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鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗原性初步研究
为了研究重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白能否作为群特异性诊断抗原加以应用,将鸡传染性支气管炎病毒国内分离株IBV-LX4核蛋白基因亚克隆于大肠杆菌原核表达载体pPROEXTMHT中,构建拟表达重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白的重组质粒pPROEXTMHT-N.经核苷酸序列测定后,阳性质粒转化大肠杆菌DH5α,并进行诱导表达.表达产物经SD S-PAGE、Western blot鉴定,表明核蛋白在大肠杆菌中获得了表达,表达产物是分子量分别为约56kD和45kD的蛋白,其中分子量为56kD的蛋白表达量约为菌体总蛋白的13%.包涵体被6mol盐酸胍裂解后,通过镍离子亲和树脂进行了纯化,并用纯化的分子量为56kD的重组蛋白免疫新西兰白兔,所获得的兔抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白多克隆抗体,分别与不同致病型的鸡传染性支气管炎病毒进行琼脂扩散反应,结果表明 ,该多克隆抗体可与各不同致病型毒株发生反应.这初步表明重组鸡传染性支气管炎病毒核蛋白,可作为群特异性诊断抗原用于该病毒的诊断中.
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汉坦病毒核蛋白原核表达纯化及其单抗制备
目的制备稳定、特异的汉坦病毒核蛋白重组抗原和单克隆抗体.方法构建汉坦病毒(HTNV)-76118株核蛋白原核表达载体(pBV)220-S1.3和(pET)28a-S1.3,大肠埃希菌诱导表达.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot分析显示,在48kD附近有目的蛋白表达,且有较好的抗原活性.用纯化的包涵体抗原免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经镍合氨基三乙酸(Ni-NAT)亲和纯化的核蛋白包被酶标板,进行ELISA筛选阳性克隆株,并建立细胞系,选2株高效分泌抗核蛋白单克隆抗体(McAb)的阳性杂交瘤细胞,常规制备腹水,进行单抗鉴定.结果成功构建了重组核蛋白原核表达载体pBV220-S1.3和pET28a-S1.3,获得了高纯度重组核蛋白(rNP)及其高效价单克隆抗体2E6和4D8.结论重组核蛋白抗原及其单克隆抗体在流行性出血热的监测、诊断和科研中有重要价值.
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抗体制备ELISA试剂诊断肾综合征出血热
目的研究汉坦病毒重组抗原及其单克隆抗体制备双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)试剂早期诊断肾综合征出血热(HFRS).方法将汉坦病毒76118株S1.3kb基因克隆于pET28a质粒,诱导大肠埃希菌表达出48kd的汉坦病毒核蛋白抗原.以此抗原免疫Balb/c小白鼠,取其B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,小鼠腹腔接种,制备单克隆抗体.用重组抗原及其单克隆抗体,制备ELISA诊断试剂,并与美国产汉坦病毒重组抗原ELISA诊断试剂和间接免疫荧光法(IFA)比较.结果自产重组抗原及其单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA试剂与美国产抗原ELISA试剂在87例HFRS和56例非HFRS诊断中完全吻合.结论自产ELISA试剂可用于早期诊断HFRS,且意义重大.
关键词： 肾综合征出血热(HFRS) 重组核蛋白 单克隆抗体 酶联免疫试验 -
普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化
目的 通过原核表达获得普马拉病毒重组核蛋白.方法 采用RT-PCR方法,从感染普马拉病毒的鼠肺标本中扩增得到编码核蛋白1-117aa的基因片段.将截短的核蛋白基因片段插入原核表达载体PQE30构建重组质粒,转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,利用Ni-NTA Agarose对表达产物进行纯化.结果 重组蛋白得到了高效表达.表达产物分子量15 000,在菌体中主要以可溶性蛋白形式存在.通过亲和层析,得到了纯化的重组蛋白.结论 普马拉病毒重组核蛋白基因片段得到了有效表达.
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汉坦病毒核蛋白基因截短片段在大肠杆菌中表达及其产物的初步应用
目的获得汉坦病毒重组核蛋白,并将其应用于血清学诊断.方法采用PCR方法,从带有HTN型Z10株病毒全长核蛋白基因的质粒上扩增读码框的前354bp的核蛋白基因片段.将截短的核蛋白基因片段插入表达载体pGEX-20T,得到重组质粒pGEX20-Z10trNP,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经Glutathione Sepharose 4B柱纯化,并进行抗原性及抗原特异性检测.结果 pGEX20-Z10trBP表达产物是相对分子质量约为40000的谷光甘肽转移酶(GST)融合蛋白GST-Z10trNP.经Western blot分析,GST-Z10trNP具有良好的抗原性.用纯化GST-Z10trNP为抗原,用ELISA间接法检测出血热病人血清、出血热疫苗免疫的家兔及小鼠血清,均能很好地区分阴性和阳性血清.结论 GST-Z10trNP表达量高,易于纯化,并且具有良好的抗原性及抗原特异性,是一种安全、廉价的诊断抗原.
关键词： 汉坦病毒 重组核蛋白 免疫印迹试验 间接酶联免疫吸附试验 -
汉滩病毒S基因全长和截短片段在大肠杆菌中表达及其初步应用
目的 体外克隆表达汉滩病毒全长及部分核蛋白编码基因,筛选病毒核蛋白在人体体液应答中的主要抗原决定簇区,以期获得高质量核蛋白抗原,为研制新型肾综合征出血热(HFRS)基因工程诊断试剂奠定基础.方法 利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶酶切的方法分离汉滩病毒76-118 S基因全长及部分氨基端编码基因(S、SA、SB、SC和SD),分别将各编码基因克隆人T7原核表达载体,在大肠杆菌中表达;免疫印迹试验(Western-blot analysis)分析重组抗原活性.结果 完整和截短核蛋白皆得到有效表达,相对分子质量分别为50 000(recombinant S protein,rS)、4 500(rSA)、22 000(rSB)、25 000(rSC)和27 000(rSD),Westem-blot分析表明截短核蛋白(rSB、rSC和rSD)具有较好的抗原活性;粗提抗原Dot-blot方法检测HFRS患者血清结果与IFA法一致;重组小片段抗原与抗汉滩病毒单克隆抗体5H5及H7可发生特异性反应.结论 汉滩病毒核蛋白的氨基端含有一主要抗原决定簇区;原核表达的截短核蛋白在HFRS的血清学诊断中具有一定的价值.
关键词： 汉滩病毒属 重组核蛋白 免疫印迹试验 间接酶联免疫吸附试验 -
汉坦病毒A537核蛋白基因的分段表达及其产物抗原活性的研究
目的 构建汉坦病毒S基因不同截短片段的重组表达质粒,并选择表达高活性的重组抗原应用于血清学诊断.方法 从HTN型A537株基因组中扩增出S全长基因,构建TA-A537S克隆;以此为模板扩增出不同长度的截短的S片段,定向插入表达载体pET-30a,获得含不同片段的重组表达载体(pET-1-112,pET-1-119,pET-1-137,pET-1-200,pET-1-292,pET-1-316,pET-1-429,pET-6-119,pET-6-137,pET-6-200,pET-6-292,pET-6-405,pET-16-112,pET-16-137,pET-26-137),并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别进行了表达;应用SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况,应用Western blot分析重组抗原的活性,采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白,用间接ELISA法对重组蛋白的抗原性及抗原特异性进行检测.结果 成功构建了含HV S全基因的TA-A537S克隆质粒;以截短的S基因片段构建的重组表达质粒中,既有表达又有活性的有pET-1-112,pET-1-119,pET-1-200,pET-1-292,pET-1-429,pET-6-119,pET-6-200,pET-6-292,pET-6-405;其中pET-6-119表达量高且活性强;经电洗脱或Ni-NTA亲和层析可获得高纯度的重组蛋白e6-119;纯化的e6-119重组蛋白应用于ELISA检测疑似HFRS和不明原因的发热病人血清IgG,与IFAT比较,其敏感性和特异性分别为94.7%,95.6%.结论 pET-6-119表达量高,易于纯化,并且具有良好的抗原性,是一种廉价、安全、可靠的诊断抗原.
关键词： 汉坦病毒 重组核蛋白 原核表达 间接酶联免疫吸附试验 -
汉滩病毒截短核蛋白在大肠杆菌中表达及其抗原分析
目的体外克隆表达肾综合征出血热病毒部分核蛋白编码基因,筛选病毒核蛋白在人体体液应答中的主要抗原决定簇区,以期获得高质量核蛋白抗原,为研制新型HFRS基因工程诊断试剂奠定基础.方法利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶酶切的方法分离汉滩病毒76-118S片段部分编码基因(SA、SB和SC),并分别克隆入T7原核表达载体,在大肠杆菌中表达;免疫印迹试验和酶联免疫吸附反应分析重组抗原活性.结果截短核蛋白得到有效表达,分子量分别约为4.5KD(rSA)、2 5kD(rSB)和15.5kD(rSC),Western-blot分析表明25kD截短核蛋白具有较好的抗原活性;粗提抗原Dot-ELISA方法检测HFRS患者血清结果与IFA法一致;25kD重组小片段抗原与抗HFRSV单克隆抗体5H5、B11及H7可发生特异性反应.结论汉滩病毒核蛋白的主要抗原决定簇主要集中在氨基端;原核表达的截短核蛋白在HFRSV感染的血清学诊断中具有一定的价值.
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汉坦病毒重组核蛋白抗体用于鼠肺组织病毒抗原的检测
目的 纯化汉坦病毒(HV)SEO型L99株重组核蛋白(rNP),制备抗体用于鼠肺组织HV抗原的检测.方法 重组菌株E. Coli BL21(DE3)/pET32a-L99S经IPTG诱导表达rNP,采用Ni亲和层析方法纯化,纯化蛋白免疫日本大耳白兔,获取抗血清用于间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺组织的HV抗原;并与病人混合血清作为一抗的IFA结果进行比较,部分标本进一步用RT-PCR法进行验证.结果 rNP表达量占菌体总蛋白的52.2%,纯化蛋白的总回收率为22.9%;纯化蛋白Western blot分析为单带,纯度达95%以上,用其制备多克隆抗体滴度达1:512000.IFA检测59份鼠肺标本,用兔rNP抗体和病人混合血清作为一抗其阳性率分别为23.7%和16.9%;两者结果不一致的6份鼠肺经RT-PCR检测HV核酸,均与兔rNP抗体的IFA结果相一致.结论 采用rNP抗体进行IFA检测,可显著地提高鼠类HV感染监测的准确性,值得推广使用.
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普马拉病毒重组核蛋白用于流行性出血热病人IgG抗体检测
目的:检测出血热病人的IgG抗体及发现在我国可能存在的普马拉病毒感染者.方法:用普马拉病毒重组核蛋白作抗原建立间接ELISA法,检测出血热病人血清中特异性IgG.结果:检测了吉林省抚松地区37份临床诊断出血热患者血清,4份血清抗普马拉病毒核蛋白IgG抗体阳性.结论:我国有可能存在普马拉病毒感染者.
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汉滩病毒重组核蛋白的克隆构建和活性初探
目的 制备新型高效的基因工程重组抗原,用于汉滩病毒的快速诊断和分型诊断.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增得到汉滩病毒S基因的截短片段,将该片段克隆入原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,将包涵体进行胶上回收,Western blotting分析其抗原性.结果 纯化得到相对分子质量约为46×103的重组蛋白,可与肾病综合征出血热(HFRS)阳性血清发生反应,健康人血清为阴性对照.结论 研究得到的重组核蛋白在HFRS的血清学诊断中具有一定的应用价值.
