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副粘病毒Tianjin株NP蛋白的表达及分析
1999年,本实验室从群体性暴发的急性呼吸道感染素致死的普通棉耳绒猴肺组织中分离到一株副粘病毒,命名为副粘病毒 Tianjin株.经研究发现该动物中心的工作人员都有此病毒抗体,且正常人群(献血员)抗体阳性率高达46%,急性呼吸道感染的患儿抗体阳性率为19.28%,提示此病原体与人类可能有密切的关系.
关键词： 副粘病毒Tianjin株 NP基因 同源性及进化分析 -
新城疫病毒NP和P基因辅助质粒的构建及鉴定
目的 构建新城疫病毒JL02/2000株P和NP基因真核表达质粒,并在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础.方法 根据新城疫病毒(JL02/2000毒株)的全基因组中的NP、P基因分别设计引物,应用RT-PCR方法扩增NP基因和P基因,将扩增的NP基因和P基因片段连接到pMD18-T载体上,限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切鉴定确认后回收目的条带,分别插入到真核表达载体pCI上,经测序确认pCI-NP、pCI-P辅助质粒的构建.将pCI-NP、pCI-P转染BHK-21细胞,两次换液,72 h后回收细胞,经RT-PCR检测NP和P基因片段. 结果 构建的辅助质粒pCI-NP和pCI-P经双酶切和测序鉴定到目的片段.pCI-NP、pCI-P转染后,RT-PCR检测到NP和P基因片段. 结论 新城疫病毒pCI-NP、pCI-P辅助质粒构建成功,pCI-NP、pCI-P可在BHK-21细胞中表达,为该病毒的反向遗传操作系统的建立奠定了基础.
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新城疫病毒TL1株NP基因的遗传变异研究
目的 分析新城疫病毒TL1株NP基因部分序列,并与代表性毒株进行比较.方法 根据GenBank登陆的新城疫病毒NP基因序列,设计了1对引物,用RT-PCR技术对新城疫病毒内蒙古分离株TL1的 NP基因进行整体扩增.将扩增产物提纯后克隆入pGEM-T easy 载体,通过酶切、PCR和测序进行验证.结果 测序拼接得出NP基因的序列长度为1 528 bp,该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489个氨基酸.与GenBank下载的14株参考毒株比较NP基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株核苷酸的同源性为99.5%,氨基酸的同源性为99.0%;与鹅源新城疫ZJ1株核苷酸的同源性为97.6%,氨基酸的同源性为99.2%,而与传统疫苗株LaSota核苷酸的同源性为85.7%,氨基酸的同源性91.6%.结论 TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株的同源性极高,它们三者亲缘关系较近,同属于基因Ⅶ型新城疫病毒,该毒株相对于经典的NDV在NP基因上已发生了较大的变异.
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副粘病毒Tianjin株NP蛋白的表达及分析
目的 分析副粘病毒Tianjin株NP蛋白与其他SeV的同源性及种系进化关系,探讨其变异及抗原性. 方法 克隆NP基因,对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性及进化分析.在原核系统中分3段表达NP蛋白. 结果 经Western blot分析,重组蛋白NP1、NP2和NP3能与副粘病毒Tianjin株抗血清特异反应,具有天然抗原性.Tianjin株与仙台病毒BB1株NP的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.5%和96.2%,与其他仙台病毒的同源性,在85.1%～88.7%和92.4%～94.7%之间.Tianjin株NP蛋白共有15个独特的氨基酸变异位点和11个与BB1株共有的变异位点.Tianjin株与BB1株NP核苷酸序列的差异大于同一进化分支内的仙台病毒之间的差异. 结论 副粘病毒Tianjin株属于仙台病毒新的进化分支.重组NP蛋白具有抗原性.
关键词： 副粘病毒Tianjin株 NP基因 原核表达 同源性及进化分析 -
广东地区人禽流感H5N1毒株的核蛋白基因变异和进化
目的 通过对人禽流感H5N1毒株核蛋白(NP)基因序列的变异分析,揭示毒株NP基因变异与进化.方法 检测广东地区人禽流感H5N1毒株NP基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株NP基因序列,采用DNAStar5.0软件对检索的人禽流感H5N1毒株NP基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果 1997-2006 年45株毒株NP基因核苷酸序列同源性分成3类,1997-1998年毒株为第1类,2004-2005 年毒株为第2类,2003年毒株和2006年毒株为第3类;NP基因35个氨基酸位点全部置换,占7.03%(35/498);2003-2006年H5N1毒株通过氨基酸第430位(K430T)位点的置换,增加一个糖基化位点(NGL430-432);GD-01-06毒株第370位发生N370S变异;增加一个糖基化位点(NES368-370).同义变异中,NP基因Ks(同义变异速度)值为2.03×10-5～2.55×10-5 核苷酸/d,Ka(错义变异速度)值为1.58×10-6～3.10×10-6 核苷酸/d,检验发现进化无明显选择性压力存在.结论 1997-1998 年毒株、2004-2005 年毒株、2003年毒株和2006年毒株NP基因核苷酸有差异;2003-2006 年人禽流感H5N1毒株NP基因增加一个糖蛋白位点、GD-01-06毒株再增加一个糖蛋白位点可能改变毒株抗原性.人禽流感H5N1毒株在自然界变异频繁,随着其自然进化,H5N1毒株具有人-人传播能力的概率较大.
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连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响研究
目的 探讨连翘苷对甲型流感病毒核蛋白(NP)基因转染后表达的影响.方法 将甲型流感病毒NP基因转染Hela细胞,用甲型流感病毒胶体金法检测连翘苷对转染后细胞内和上清核蛋白表达情况,用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hela细胞内NP基因的拷贝数.结果 NP重组质粒组甲型流感病毒核蛋白含量高.空质粒组、脂质体组、Hela细胞组基本不含甲型流感病毒核蛋白.连翘苷组上清无或可能含有微量核蛋白.连翘苷组胞内甲型流感病毒含量不高.RT-PCR校正曲线相关性为0.998,效率为97.4%.重复4次转染后48 h连翘苷组NP基因表达量为(2.1±0.3)×105拷贝数/μl,NP重组质粒组NP基因表达量为(61.5±15.0)×105拷贝数/μl,连翘苷组NP基因表达量低于NP重组质粒组,差异有统计学意义(t=7.672,P＜0.05).结论 连翘苷可以抑制甲型流感病毒NP基因转染后表达.
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河南猪流感病毒H3N2分离株NP基因表达及抗原性分析
目的 表达猪流感病毒(swine influenza virus,SIV) H3N2分离株NP基因,获得具有良好抗原性的NP蛋白.方法 PCR扩增猪流感病毒A/swine/Henan/2/2008(H3N2) NP基因,经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后插入pET32a(+)载体,并转化大肠杆菌Rosset(DE3)菌株;PCR、EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pET32a-NP;IPTG诱导,表达、纯化NP并免疫家兔制备免疫血清,SDS-PAGE、WB测其反应原性;同时构建pcDNA3.1-NP并转染293T细胞,免疫荧光检测其免疫源性.结果 成功构建重组载体pET32a-NP和pcDNA3.1-NP,SDS-PAGE和WB显示融合蛋白约80 kD,能与感染SIV的猪血清特异性反应,并且纯化蛋白制备的多克隆血清能识别293T细胞中表达的NP蛋白.结论 正确表达SIV H3N2 NP蛋白,并有良好的抗原性,为研究猪流感病毒NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定基础.
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2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白及核蛋白基因进化分析
目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)基质蛋白(M)及核蛋白(NP)基因的进化规律.方法:从NCBI数据库下载147条甲型H1N1流感病毒M基因及NP基因序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件对M基因和NP基因序列进行比对,并用NJ法构建进化树,同时采用Epi Info软件分析1918～2009年人H1N1病毒的M基因和NP基因序列进化距离的线性趋势.采用MEGA4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对.结果:不同地区的2009年新型甲型H1N1流感病毒M基因、NP基因同源性高,但与历史上流行的H1N1流感病毒M基因、NP基因差异较大,且M基因进化距离随分离年限变化的趋势性检验结果有统计学意义(Ptrend=0.001).2009年新型甲型A/H1N1流感病毒M2蛋白与1918～2008年人A/H1N1病毒M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示在第11、43、54、57、77、78 氨基酸位点发生了改变;与猪、禽A/H1N1的M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示仅在第43、77位氨基酸位点发生改变.结论:2009年新型甲型A/H1N1流感病毒NP基因片段较以往流行的人H1N1流感病毒NP基因发生了改变;M2蛋白位于胞外编码区的第11位氨基酸、位于TM结构域的第43位氨基酸突变可能导致了新型甲型A/H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药.
关键词： H1N1甲型流感病毒 M基因 NP基因 进化 -
狂犬病病毒NP基因的克隆及真核表达
目的 检测狂犬病毒NP蛋白的免疫原性.方法 利用RT-PCR扩增狂犬病毒核蛋白(NP)基因,测序后将其克隆到PVAX1真核表达载体上;将PVAX1-NP转染Vero细胞,进行SDS-PAGE及Western-blot分析;以重组质粒PVAX1-NP对小鼠进行免疫试验.结果 经酶切分析、鉴定和测序验证,得到重组表达质粒PVAX1-NP,NP蛋白在Vero细胞中获得了表达,且表达产物具有免疫学活性;免疫小鼠抗体水平显著升高.结论 狂犬病毒NP蛋白具有免疫原性.
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输入性甲型H1N1流感病毒M、NP、PB1基因进化特征
目的 分析口岸输入性甲型H1N1流感病毒的M、NP和PB1基因进化特征,及时发现变异株.方法 对广东口岸2009-2011年检测的甲型H1N1流感阳性病例进行M、NP和PB1基因的RT-PCR扩增和核苷酸序列测定.以2009年甲型H1N1流感代表株A/California/04/2009/H1 N1的M、NP和PB1基因作为参考序列,分析输入性病例的系统进化树、核苷酸及氨基酸序列同源性和变异位点.结果 M基因系统进化树分为4个分支,2009年病毒与2010年病毒主要分布在第Ⅰ分支,2011年检出的多数病毒聚集于第Ⅳ分支.同源性结果显示M基因高度保守,仅有5个核苷酸位点发生显著变异,对应的蛋白序列仅在氨基酸V80I位点出现突变.所有病毒NP蛋白均出现V100I突变,同时零星出现K452R突变.PB1蛋白氨基酸序列在G154D、I397M和I435T等位点发生较明显突变.结论 2009-2011年输入性甲型H1N1流感病毒M、NP、PB1基因已发生一定程度的变异,对口岸和国内流感防控提供了重要的理论依据.
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甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达
目的 构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况.方法 采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达.结果 RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达.结论 本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础.
关键词： 甲型流感病毒 NP基因 pcDNA3.1(+) 免疫荧光技术 -
禽流感病毒NP基因的酵母双杂交饵载体表达及自激活检测
目的 构建H5N1亚型禽流感病毒NP基因的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用.方法以PCR法从pGEMT/H5NP扩增NP基因编码区序列,将其定向克隆到PGBKT7载体,经测序鉴定后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Western blot验证诱饵蛋白的表达.结果获得NP编码区基因,并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7-NP,对宿主细胞酵母菌株AH109无毒性和自激活作用,并能在酵母细胞中稳定表达.结论诱饵载体pGBKT7-NP可用于GAL4酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白.
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不同连翘制剂对甲型流感病毒NP基因转染后表达的影响
目的：观察连翘苷、连翘醇提液、连翘水煎剂等3种连翘制剂对甲型流感病毒甲1型流感病毒核蛋白（ nucleoprotein，NP）基因转染后表达的影响。方法：将甲型流感病毒NP基因转染Hela细胞，用甲型流感病毒胶体金检测3种连翘制剂对转染后细胞内和上清核蛋白表达情况，用RT_PCR检测转染后Hela细胞内NP基因的拷贝数。结果：NP重组质粒组上清胶体金检测为阳性，连翘苷组上清为阴性、细胞内为弱阳性；连翘水煎剂及连翘醇提物组上清均为弱阳性。连翘苷组NP基因表达量较NP重组质粒组减少（ P<0.05）。结论：连翘苷抑制甲型流感病毒NP基因转染后表达作用强。
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RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制
目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖. 方法: 分别构建针对NP,PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP,pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA,转染MDCK后,H5N1亚型流感病毒感染细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值(HA),观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力. 结果: 荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达65.0%. 蛋白质印迹结果表明,重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达,两者的抑制率分别为64.5%和69.6%. 半定量RT-PCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%;pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%;pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率,分别为71.4%和69.3%. 而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. HA结果表明,三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,以pEGFP6/NP+PA的作用为显著,它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%,75.0%和96.9%. 结论: NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达,并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.
