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BACE1基因RNA干扰质粒的构建及干扰效果的鉴定
目的 构建BACE1基因干扰质粒,并研究其在neuro-2a细胞中的表达,为以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的质粒.方法 选择人、小鼠和大鼠的BACE1基因共有序列为干扰靶点,设计3组连接有GFP的干扰质粒,将构建好的质粒转染neuro-2a细胞,通过Real time RT-PCR及Western-blotting的方法分别在RNA及蛋白质水平上检测BACE1的表达,以分析其干扰的效率.结果 经酶切及测序证实,插入的DNA片段序列与设计序列完全一致.与空质粒对照组相比,3个干扰靶点对BACE1基因的表达均有不同程度的抑制作用.其中pYr-1.1-siBACE1在mRNA水平及蛋白质水平干扰效果均好.结论 成功构建了BACE1基因的干扰质粒pYr-1.1-siBACE1,并能有效抑制neuro-2a细胞内源性BACE1基因表达,为靶向BACE1基因的治疗提供了有力的工具.
关键词： BACE1 基因 RNA干扰 neuro-2a细胞 -
C57小鼠 LATl 真核表达载体的构建及其对Neuro-2a 细胞的影响
目的：构建C57小鼠L型氨基酸转运载体1（ LAT1）的真核表达载体，转染Neuro-2a肿瘤细胞进行表达，探讨LAT1对Neuro-2a细胞增殖及凋亡的影响。方法采用RT-PCR扩增出LAT1全长目的基因，定向克隆pcDNA3.1表达载体，构建pcDNA3.1-LAT1重组表达质粒，通过脂质体法将阳性克隆转染Neuro-2a细胞，经G418筛选获得稳定表达株后，用RT-PCR和western blot 蛋白印迹法检测LAT1的表达情况。通过MTT法检测各组Neuro-2a细胞的增殖情况，并借助流式细胞仪检测LAT1对Neuro-2a细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建小鼠pcDNA3.1-LAT1真核表达载体，酶切和测序证实其序列正确，并成功转染Neuro-2a细胞建立稳定转染细胞系。MTT法显示转染重组质粒pcDNA3.1-LAT1的Neuro-2a细胞增殖速度显著高于对照组（P ＜0.05），且流式细胞术检测转染组对Neuro-2a细胞具有促进增殖抑制凋亡的作用。结论转染 pcDNA3.1-LAT1质粒的Neuro-2a细胞能成功表达LAT1蛋白，且LAT1对Neuro-2a细胞的增殖和凋亡均有显著影响，为进一步研究LAT1的生物学作用奠定了重要基础。
关键词： L型氨基酸转运载体1 真核表达载体 neuro-2a细胞 增殖 凋亡 -
β淀粉样蛋白与氧应激的相互作用及PACAP-27对氧应激损伤的保护作用
目的:探讨β淀粉样蛋白(Aβ)与氧应激损伤的相互关系及脑下垂体腺苷环化酶激活多肽-27(PACAP-27)对抗氧应激致神经瘤细胞损伤的作用机理.方法:体外培养第150代Neuro-2a细胞,MTT法检测细胞存活率,Heochest33258特异细胞核染色观察凋亡小体,提取基因组DNA鉴定细胞死亡方式及基因组内小片段含量.结果:过氧化氢(H2O2)处理接种24 h的Neuro-2a细胞24 h后,浓度相关地使细胞存活率下降,10 mol·L-1时有明显的凋亡特征出现;与25 mol·L-1的Aβ25-35共同处理24 h可以使H2O2损伤神经元的ED50降低至1/10;PACAP-27(0.1(mol·L-1,1 d加药1次,共2次)对H2O2所致的细胞损伤有显著的保护作用,可以提高细胞的存活率,降低基因组小片段DNA的含量;PACAP受体拮抗剂PACAP 6-27(100mol·L-1,与PACAP同时加药)不能拮抗PACAP-27的保护作用.结论:氧应激与Aβ在神经毒性方面有协同作用;PACAP参与对抗H2O2的神经毒性时,不通过受体激活.
关键词： β淀粉样蛋白 过氧化氢 垂体腺苷环化酶激活多肽 neuro-2a细胞 细胞培养 凋亡 -
心脑舒通对缺氧/复氧损伤神经细胞的保护作用及其机制研究
[目的]研究心脑舒通对缺氧/复氧损伤神经细胞的保护作用及其机制.[方法]体外培养Neuro-2a细胞,分为正常对照组、缺氧/复氧损伤模型组、心脑舒通(10、25、50 mg/L)给药组,建立缺氧缺糖(OGD)4 h/复氧复糖(Rep)24 h损伤模型,检测心脑舒通对各组细胞增殖活力、乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位(△φm)的影响.[结果]与缺氧/复氧组比较,心脑舒通可以明显增加Neuro-2a细胞活力,减少LDH漏出,降低ROS水平,增强线粒体膜电位.[结论]心脑舒通对缺氧/复氧损伤神经细胞具有明显保护作用,其机制与其影响活性氧水平和线粒体膜电位有关.
关键词： 心脑舒通 神经保护 缺氧/复氧 neuro-2a细胞 -
ARIP1,2在小鼠Neuro-2a细胞中的表达研究
目的 探讨激活素受体相互作用蛋白1,2(ARIP1,2)在小鼠神经细胞中表达及其作用的差异.方法 实时定量PCR检测ARIP1,2 mRNA,免疫细胞化学染色检测ARIP1,2蛋白.结果 实时定量PCR显示APdP1,2 mRNA在小鼠脑神经瘤细胞系Neuro-2a细胞均有表达,免疫细胞化学染色进一步证实Neuro-2a细胞表达ARIP1,2成熟蛋白,LPS可以上调ARIP1,2蛋白表达.在Neuro-2a细胞过表达ARIP1,2均能抑制Activin A诱导的特异基因转录,ARIP1还能抑制Smad3诱导的基因转录.结论 ARIP1,2均可在神经细胞表达,但其在神经细胞中介导激活素生物学作用存在差异,其差异的机制尚有待进一步研究.
关键词： neuro-2a细胞 激活素 受体相互作用蛋白 -
LipofectamineTM2000转染Neuro-2a细胞实验条件的优化
目的 优化LipofectamineTM 2000介导外源基因转染Neuro-2a(N-2a)细胞的条件,以提高转染效率.方法 将携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的真核表达载体pEGFP-N1在LipofectamineTM2000介导下转染N-2a细胞,对转染时间、细胞融合度、质粒质量与脂质体体积比例及培养基pH值进行优化,荧光显微镜观察EGFP的表达,并计算转染效率.结果 在细胞融合度达80％,质粒质量与脂质体体积比为1:3的条件下转染48 h,EGFP的阳性率高(P＜0.05)；培养基pH值为8.0左右时,EGFP的阳性率较高,且细胞凋亡率较低.结论 优化了LipofectamineTM 2000转染N-2a细胞的条件,提高了转染效率,为外源基因高效转染N-2a细胞奠定了基础.
关键词： 脂质体 neuro-2a细胞 转染 绿色荧光蛋白 优化 -
D609对Neuro-2a脑神经瘤细胞增殖和细胞周期的影响
目的:探讨小分子化合物D609对脑神经瘤细胞Neuro-2a的生长抑制及诱导细胞周期阻滞的效应,并初步研究其机制.方法:采用CCK-8法检测D609对Neuro-2a细胞的生长抑制作用;利用流式细胞术(FACS)检测D609处理对细胞周期进程的影响;利用免疫印迹实验(Western blot)检测不同浓度的D609处理后,细胞裂解液中细胞周期蛋白抑制因子p27的表达水平.结果:CCK-8的实验结果显示,加入150 μmol/L D609处理72小时后,细胞生长受到明显地抑制,且伴有剂量依赖效应;流式细胞术的结果表明,D609处理使细胞周期阻滞在G0/G1期;免疫印迹的结果表明药物处理提升了p27的表达,且随药物浓度升高其表达亦增强.结论:D609可以有效地抑制Neuro-2a细胞的生长;进一步研究表明药物处理可以提升p27的表达水平并可以诱导将细胞阻滞在G0/G1期.因此,此研究将为脑神经瘤的治疗提供借鉴.
关键词： D609 neuro-2a细胞 生长抑制 细胞周期阻滞 p27 -
人参皂苷Rg1对神经细胞衰老和衰老相关异染色质聚集的影响
目的 探讨人参皂苷Rg1预处理对三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的神经细胞衰老及异染色质聚集(SAHF)的影响.方法 常规培养Neuro-2a细胞株,在造模药物刺激前,给予不同剂量的人参皂苷Rg1,同时设置模型对照组、正常对照组.进行细胞活力检测、衰老相关半乳糖苷酶染色、衰老相关异染色质聚集检测.结果 人参皂苷Rg1预处理可改善t-BHP诱导的细胞活力降低,此改善呈剂量依赖性;人参皂苷Rg1预处理各组,SA-β-gal染色细胞阳性数呈剂量依赖性降低;人参皂苷Rg1预处理可预防t-BHP诱导的SAHF形成,呈显著剂量依赖性.结论 人参皂苷Rg1预处理可剂量依赖性地预防神经细胞衰老,防止异染色质聚集,有必要进一步研究.
关键词： neuro-2a细胞 人参皂苷Rg1 细胞衰老 衰老相关异染色质聚集 -
鱼藤素降低小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2 A存活率的实验研究
目的：研究鱼藤素对小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro-2A ( N2A)存活率及凋亡的影响。方法： N2A细胞以5×104· ml-1密度接种到细胞培养板中,1×10-8 mol·L-1鱼藤素处理后6,12,24,48,72 h等5个时间点上测定细胞存活率；加入鱼藤素0,1×10-11,1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6 mol·L-1等7个不同浓度干预48 h后测定细胞存活率。2×10-8 mol·L-1鱼藤素干预24 h,测定细胞匀浆中caspase 3活力。结果：5×104·ml-1 N2A细胞以含10%胎牛血清DMEM培养基培养,第48 h达到细胞生长曲线的峰值。1×10-8 mol·L-1鱼藤素干预24~72 h,时间依赖性显著降低N2A细胞存活率(P<0.05)；在鱼藤素干预48 h时间点上,1×10-8~1×10-6·mol·L-1浓度范围内剂量依赖性可显著降低N2A细胞存活率(P<0.05),其IC50=1.6×10-8 mol·L-1。鱼藤素作用于N2A细胞24 h可显著提高caspase 3活力,约达到对照组的5.6倍。结论：鱼藤素可时间依赖性且剂量依赖性降低N2A细胞存活率,可能与增加caspase 3活力有关。
关键词： 鱼藤素 neuro-2a细胞 细胞存活率 Caspase 3 -
京尼平通过线粒体动力学缓解氧化应激诱导的Neuro-2a细胞凋亡
目的:观察京尼平(genipin) 对 H2O2诱导 Neuro-2a细胞凋亡的影响,并对其机制进行初步探讨.方法:体外培养Neuro-2a细胞,利用400 μmol/L H2O2诱导6 h建立 Neuro-2a凋亡模型.处于对数生长期的Neuro-2a细胞随机分为对照组、模型组、京尼平组、京尼平预处理后模型组.MTT法测定细胞存活率;倒置相差显微镜观察细胞形态;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡率;DCFH-DA(2,7-二氯荧光素二乙酸酯)染色、流式细胞仪检测细胞内线粒体活性氧(ROS) 的产生;qRT-PCR检测UCP2、UCP4、Mfn2、Drp1 mRNA表达;Western blot测定UCP2、UCP4、Mfn2、Drp1蛋白表达.结果:与对照组相比,模型组细胞存活率显著降低,细胞凋亡率增加,ROS生成量升高,同时UCP2、Drp1 蛋白及 mRNA表达增加,Mfn2 蛋白及 mRNA表达降低, UCP4及mRNA蛋白表达无明显变化.提前给予京尼平(40 μmol/L) 干预后,与模型组相比,细胞存活率提高,细胞凋亡率降低,ROS生成量减少,同时UCP2、Drp1蛋白及mRNA表达减少,Mfn2蛋白及mRNA表达升高,但UCP4蛋白及mRNA表达无明显变化.以上指标相比,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01) .结论:适宜浓度的京尼平能缓解氧化应激诱导的Neuro-2a细胞凋亡,其机制可能与抑制UCP2蛋白表达,促进线粒体融合进而改善线粒体功能有关.
关键词： 京尼平 neuro-2a细胞 线粒体融合 氧化应激 凋亡
