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共培养人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)和兔关节软骨细胞诱导hUC-MSCs分化成软骨细胞
目的 探讨兔膝关节软骨细胞和人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的共培养对hUC-MSCs成软骨诱导分化的影响及共培养的佳比例.方法 分离培养hUC-MSCs和兔膝关节软骨细胞并鉴定其特异性.在Transwell体系中,按1∶4,1∶3,1∶2,1∶1,2∶1,3∶1及4∶1的比例(hUC-MSCs:兔膝关节软骨细胞)共培养.倒置相差显微镜观察细胞的形态与增殖;甲苯胺蓝染色及免疫荧光染色分别检测葡萄糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原(COL2A1)(蛋白水平定性);并对各组细胞爬片进行GAG、COL2A1定量检测;同时用实时定量荧光PCR(pPCR)检测GAG、COL2A1 mRNA表达,观察共培养前后细胞的基质分泌情况.结果 共培养21 d后,阳性对照组和实验组细胞甲苯胺蓝染色及免疫荧光反应均呈阳性;GAG、COL2A1含量及mRNA表达量1∶4实验组均要高于其他实验组和阳性对照组.结论 hUC-MSCs和兔关节软骨细胞的共培养可明显促进hUC-MSCs向软骨样细胞诱导分化,且佳共培养比例为1∶4.
关键词： Transwell小室 人脐带间充质干细胞 兔膝关节软骨细胞 共培养 成软骨诱导 -
人脐带间充质干细胞成软骨诱导过程中软骨标志基因表达的研究
目的：观察脐带间充质干细胞（UCMSCs）体外生物学特征，分析成软骨诱导过程中软骨标志基因的表达，探索分化的佳时间，为其以后应用于组织工程奠定基础。方法体外培养UCMSCs并使用特定的诱导培养基对第3代UCMSCs进行成脂、成骨、成软骨诱导培养并染色鉴定，流式细胞术检测细胞表面标志物，实时定量PCR检测成软骨诱导0、3、7、14、21 d后SOX9、COL2A1、ACAN的mRNA的表达水平。结果 UCMSCs经过体外培养后，细胞形态均一，呈梭形。UCMSCs经成脂、成骨、成软骨诱导后油红O、茜素红、阿利新蓝染色分别呈阳性反应。流式细胞术检测发现UCMSCs低表达CD34、CD45，高表达CD44、CD105。成软骨标志基因SOX9、COL2A1 mRNA的表达在诱导14 d达到高水平，ACAN的mRNA的表达在诱导7 d达到高水平。结论 UCMSCs体外传代培养3代后依然可以保持干细胞的特性，其体外诱导成软骨的佳时间为14 d。
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人滑膜间充质干细胞的分离培养与鉴定
背景：软骨一旦损伤将很难自我修复，组织工程学修复损伤软骨是目前的研究热点。组织工程学中找到合适的“种子细胞”至关重要。滑膜间充质干细胞（SMSCs）因较其他来源的间充质干细胞成软骨能力、增殖能力更强，且细胞容易获取、对机体损伤小等优点，越来越受到研究者的青睐。
目的：探讨人SMSCs体外分离、培养的方法与步骤，探索对SMSCs进行鉴定的新方法。
方法：关节镜下获取11例行关节镜手术患者的滑膜组织，按照Pei等[6]的方法分离培养滑膜干细胞；从细胞形态学观察、细胞生长曲线分析、CCK-8测定增殖活力、流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原、对SMSCs进行成脂/成骨/成软骨诱导、免疫细胞荧光染色以及RT-PCR检测成脂/成骨/成软骨相关基因的表达等方面对SMSCs进行鉴定。
结果与结论：按照Pei等的方法可以成功地从人滑膜组织中分离出干细胞，分离出的干细胞具有间充质干细胞特异性表型和多向分化潜能。 -
全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性
背景：饲养层细胞多数利用丝裂霉素C来处理，虽丝裂霉素C抑制了细胞增殖，但是细胞仍处于有分泌功能的活性状态，能够分泌不同的细胞因子。而骨髓中的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子，保持间充质细胞生长的微环境，提高间充质干细胞的产量。
目的：探究全骨髓培养法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。
方法：采用全骨髓贴壁法纯化扩增C57小鼠的骨髓间充质干细胞，检测细胞增殖的动力学变化、细胞表面的免疫标志物、多向分化的潜能及细胞周期的变化。
结果与结论：全骨髓培养法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有黏附于塑料培养器皿的能力，流式细胞仪检测表达CD45，CD105和Sca-1，不表达CD34，CD133和C-kit等间充质干细胞的表面标记特征；细胞倍增时间(57.11±1.5) h；诱导后具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力；细胞周期分析表明64%的细胞处于G 0-G 1期。提示全骨髓培养法获取的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的生物学特征。 -
脂肪基质干细胞复合小肠黏膜下层治疗家兔生长板缺损
背景:小肠黏膜下层具有良好的生物相容性,与其主要的胶原成分在进化上的高度保守性及其快速降解性有关.目的:观察经体外成软骨诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物用于治疗家兔胫骨近端内侧生长板缺损的疗效.方法:36只新西兰大耳白兔随机分为3组,均造成右侧胫骨近端内侧生长板50%的缺损.空白组不植入填充物,小肠黏膜下层支架组缺损填充空白小肠黏膜下层支架材料,脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组填充在体外进行成软骨诱导14 d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物.结果与结论:X射线片测量结果:16周时胫骨近端关节面成角差值,空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05).胫骨长度差值空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05).苏木精-伊红染色显示:16周时,空白组生长板骨桥未被吸收,生长板外侧闭合,小肠黏膜下层支架组生长板缺损内骨桥致密,生长板软骨中断,生长板外侧闭合;脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组生长板为软骨性修复,软骨呈柱状排列,生长板未闭合.提示,体外成软骨诱导分化后的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物,用于治疗家兔胫骨近端生长板缺损,有效避免了肢体的成角和短缩畸形,并且能够修复生长板软骨.
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成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片修复肋软骨供区缺损的实验研究
目的 采用兔胸廓损伤动物模型,观察成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片对肋软骨供区再生修复的影响.方法 将16只家兔随机分为4组,每组4只,分别为健康对照组,实验1、2、3组.健康对照组家兔无任何处理,对实验组的每组双侧第4～6肋软骨均采用不同的2种方法处理,同侧3根肋软骨采用同一种方法处理,3种方法在每组中两两配对.3种方法分别为:①直接缝合软骨膜;②骨髓间充质干细胞膜片折叠数层成圆筒状填塞入肋软骨缺损处缝合;③成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片同法折叠数层成圆筒状填塞入肋软骨缺损处,缝合封闭缺损.3种方法在各实验组兔两侧肋软骨中两两配对,健康对照组不做处理.术后16周,处死家兔取材进行大体观察,常规HE染色,并行生物力学检测,测定所有肋软骨的抗压强度及弯曲强度.结果 各实验组家兔的胸廓整体形态均较良好,各组及各处理方法间无明显差别.生物力学检测显示,3种处理方法之间均存在差异(P＜0.01),方法3处理的修复组织的抗压、弯曲强度与健康对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);方法1、2处理的修复组织的抗压、弯曲强度明显低于健康对照组(P＜0.01);方法2处理的修复组织的抗压、弯曲强度优于方法1.组织切片HE染色病理观察,可见方法1、2处理的修复组织主要为纤维组织,方法3处理的修复组织内,可见新生的软骨细胞和大量的软骨细胞外基质.结论 成软骨诱导的骨髓间充质干细胞膜片可以促进肋软骨供区软骨细胞的再生,修复肋软骨供区缺损,维持胸廓的正常形态和稳定性,从而降低术后胸廓畸形的发生率.
关键词： 骨髓间充质干细胞膜片 成软骨诱导 肋软骨再生 修复 -
MicroRNA-140靶向组蛋白去乙酰化酶7基因及在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中的表达分析
目的 检测组蛋白去乙酰化酶7(HDAC7)是否为MicroRNA(miRNA)-140的靶基因,并研究在大鼠骨髓间充质干细胞(ratMSCs)成软骨诱导分化中miRNA-140和HDAC7表达的相关性.方法 利用生物信息学、双荧光素酶报告基因检测以及Western blot法鉴定miRNA-140与HDAC7之间的靶作用关系.选取4周龄Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠采用全骨髓贴壁法进行体外分离培养纯化得到大鼠骨髓间充质干细胞并向成软骨方向诱导分化,同时采用实时定量PCR和Western blot法检测miRNA-140和HDAC7的表达水平.结果 双荧光素酶活性分析结果提示,miRNA-140靶结合人HDAC7基因的3' UTR.将miRNA-140 mimics转染大鼠骨髓间充质干细胞后抑制HDAC7的蛋白表达.在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中,miRNA-140表达上调,而HDAC7表达下降.结论 miRNA-140通过靶结合HDAC7基因的3'UTR抑制HDAC7表达,二者在大鼠骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中表达负相关,提示miRNA-140通过抑制HDAC7蛋白表达保护软骨组织.
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细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响
目的:观察在成软骨诱导培养条件下,细胞传代对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外成软骨能力的影响.方法:不同代MSCs成软骨诱导后,观察细胞生物学特性以及通过免疫荧光、RT-PCR测定特异性软骨细胞外基质aggrecan的表达情况.结果:经成软骨诱导后,第2、4代MSCs表达aggrecan明显较第6、8代细胞高.结论:MSCs很可能由多种形态功能接近,分化潜能有略有差异的细胞组成;在成软骨诱导培养条件下,对此传代后成软骨能力减弱.
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基于双荧光素酶报告基因系统建立miR-140生物传感器
目的：利用双荧光素酶报告基因系统构建可检测miR-140活性的生物传感器。方法：首先，在psiCHECK-2双荧光报告基因质粒的多克隆位点插入miR-140成熟体的4个拷贝反义序列，构建miR-140 sensor。其次，将miR-140 sensor和miR-140 mimics共转染HEK-293 T细胞，利用双荧光素酶报告基因系统检验miR-140 sensor的功能。后，转染miR-140 sensor至大鼠骨髓间充质干细胞（ rat MSCs ），分析在成软骨诱导中miR-140的活性变化，并与miR-140的表达水平相比较。结果：在HEK-293T细胞中，相对于阴性对照组，miR-140 sensor与miR-140 mimics共转能明显降低49％（20 nmol· L-1）和65％（50 nmol· L-1）的荧光活性。将转染miR-140 sensor的rat MSCs成软骨诱导7 d后，荧光活性降低43％，提示miR-140活性升高，与RT-qPCR法检测的miR-140表达水平相一致。结论：构建的miR-140 sensor是一种简单方便有效的miRNA传感器，可用于检测miR-140活性。
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人脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的实验研究
目的了解从人体抽吸的脂肪组织中获得的脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的情况.方法临床提取8例人脂肪抽吸组织中的间充质干细胞,在体外分别进行成脂和成软骨诱导分化,并通过油红0染色、阿尔辛蓝染色和免疫组化的方法进行证实.结果脂肪干细胞经成脂诱导后,向成脂细胞分化,细胞内出现油红0染色阳性脂滴;经成软骨诱导后,细胞向成软骨细胞分化,分泌软骨特异性基质成分硫酸蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.结论在适当的诱导条件下,来源于人体多部位脂肪抽吸组织中的干细胞具有向成脂和成软骨细胞分化的能力,本实验为进一步应用人体脂肪干细胞进行脂肪和软骨组织工程研究打下实验基础.
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IGF-1与TGF-β1联合诱导藻酸钙-脂肪干细胞混合凝珠软骨化的研究
目的 探讨以藻酸钙凝珠为载体的立体培养的兔脂肪于细胞(ADSCs),胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子β1(TGF-β1)共同诱导下向软骨细胞分化的作用.方法 利用新西兰大白兔提取兔AD-SCs培养传代并鉴定.取第3代ADSCs制成藻酸钙-脂肪干细胞混合凝珠进行立体培养并分为4组:A组(未诱导组)、B组(IGF-1诱导组)、C组(TGF-β1诱导组)、D组(TGF-β1和IGF-1联合诱导组).连续培养3周后对细胞采用HE染色、免疫组化染色方法进行检测,对比各组之间的表达结果.结果 流式细胞术的结果显示提取细胞中ADSCs的纯度＞95％;HE染色结果表明细胞分化:D组＞C组＞B组,A组无明显变化;利用Scion Image图像分析免疫组化中Ⅱ型胶原表达量:D组＞C组＞B组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 以藻酸钙凝珠为载体的脂肪干细胞能定向诱导成软骨细胞,并且在立体培养TGF-β1+IGF-1两种生长因子联合诱导优于TGF-β1或IGF-1单一诱导,两者之间起协同作用.
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用单层培养法诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究
骨髓间充质干细胞(MSCs)因其具有多向分化潜能,易于分离,且体外扩增能力强,便于自体移植的特点,近年来被认为是有希望的种子细胞来源[1,2].2000年以来,我们在体外培养条件下采用单层培养方式分阶段研究MSCs这一分化机制,研究骨髓间充质干细胞向成软骨诱导的条件、分化模型及其相互关系,从而为气管、甲状软骨等组织工程重建提供种子细胞的可能性.
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三明治法构建兔间充质干细胞-脱细胞真皮基质定向分化成软骨培养的研究
目的 探索天然的脱细胞真皮基质(ADM)的制备方法；观察ADM的孑孔隙率和生物力学特性；探讨间充质干细胞(MSCs)结合ADM支架材料的生物学特性.方法 选用新西兰兔的皮肤作为原料,切取厚度为500 μm的真皮层,切成1.5 cm×1.5 cm的正方形小块,采用化学、物理和生物综合技术制备ADM支架材料,并对其进行孔隙率和生物力学检测.采用三明治法将MSCs与ADM复合培养并定向诱导分化成软骨,然后分别进行扫描电镜观察、激光扫描共聚焦显微镜观察和成软骨分化检测等分析比较.结果 ADM的孔隙率为80.26％.ADM的拉伸强度为4.52 Mpa.将sC-MSCs种植在ADM上,经过21 d的体外培养,硫酸糖胺聚糖(sGAG)的平均值为(4.6±0.9)μg/mg,与第3天的sGAG值(1.1±0.2)μg/mg比较,差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅱ型胶原的含量第21天也比第3天增加[(6.2 ±0.9)μg/mg比(2.4 ±0.6)μg/mg],差异有统计学意义(P＜0.05).扫描电镜观察和激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示,ADM为MSCs的增殖和分化提供了充足的空间,MSCs种植在ADM支架中分布均匀,并且长期存活,具有良好的生物细胞相容性.结论 ADM支架材料未发现有细胞毒性,同时具有较为合适的孔隙率,更利于植入细胞的黏附与增殖；在处理过程中,能保持ADM的生物力学性能.用三明治法构建MSCs-ADM具有良好的成软骨定向分化的能力.
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IL-1β对人颞下颌关节滑液间充质干细胞生物学特性的影响
目的 探讨白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)对人颞下颌关节滑液间充质干细胞(human synovial fluid mesenchymal stem cells,hSFMSCs)生物学特性的影响.方法 将临床收集的颞下颌关节紊乱病(temporomandibular disorder,TMD)患者颞下颌关节滑液的样本进行体外培养扩增获得hSFMSCs,将hSFMSCs分为3组:对照组用完全培养基(α-MEM细胞培养基+10％ FBS+1×GlutaMAX)常规培养(命名为0 ng/mL IL-1β组),IL-1β刺激组分别于完全培养基中加入rhIL-1β 1 ng/mL(1 ng/mL IL-1β组)和rhIL-1β 10 ng/mL(10 ng/mLIL-1β组),根据实验不同需求分组干预.通过细胞克隆形成率比较IL-1β对hSFMSCs接种后贴壁及增殖能力的差异,CCK8法检测IL-1β对hSFMSCs细胞增殖的影响,分别使用细胞周期检测试剂盒和Annexin V/PI凋亡检测试剂盒检测IL-1β对hSFMSCs的细胞周期和凋亡的影响.采用形态学和相关基因的定量检测评价IL-1β对hSFMSCs成骨诱导、成脂诱导、成软骨诱导等多向分化能力的影响.结果 不同浓度IL-1β刺激下对hSFM-SCs细胞克隆形成率(F=0.665,P=0.548)、细胞增殖(F=0.001,P=0.999)、细胞周期(FC1期=0.773,PC1期=0.503;Fs期=0.636,Ps期=0.562)和凋亡(F=0.196,P=0.827)的影响没有统计学意义.hSFMSCs成骨诱导中茜素红染色形成的矿化结节随IL-1β刺激浓度的增加逐渐较少,IL-1β刺激组Runt相关基因2(runt-related transcription factor2,RUNX2)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的mRNA表达均显著低于0 ng/mL IL-1β组(P＜0.05);成脂诱导下随着IL-1β刺激浓度的增加,脂滴形成明显减少,实时荧光定量PCR检测显示成脂诱导下,与同期0ng/mL IL-1β组之间比较,IL-1β刺激组成脂分化的相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体G2 (peroxisomal proliferative receptor G2,PPARG2)和脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)mRNA表达明显降低(P＜0.05).各浓度IL-1β介导成软骨诱导后虽然均形成软骨微球,但Sry基因相关HMG box-9 (sexdeter mining region Y related high-mobility group box-9,SOX9)和Ⅱ型胶原(collagenⅡ,COL-Ⅱ)基因的mRNA表达随着IL-1β的刺激而降低(P＜0.05),而基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)基因在IL-1β刺激下则mRNA表达明显增加(P＜0.05).结论IL-1β对hSFMSCs细胞生长增殖或凋亡无显著性影响,而直接影响其多向分化能力.
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生长因子对人脂肪干细胞成软骨诱导作用研究
人脂肪干细胞(hADSCs)的成软骨潜能是近年来组织工程学研究的热点之一,而生长因子是诱导hADSCs向软骨细胞分化的关键因素.目前用于软骨诱导的生长因子多来自转化生长因子(TGF)-β超家族,其中以TGF-β1/3为常见.但hADSCs与人骨髓干细胞(hBMSCs)对TGF-β的反应存在差异,且研究发现,骨形态发生蛋白-6(BMP-6)可以显著上调hADSCs的TGF-β Ⅰ型受体的表达水平,因此传统的hBMSCs软骨诱导液未必同样适合hADSCs.于是本文结合近年来的相关研究,对用于hADSCs成软骨诱导的生长因子做一综述.
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大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较
目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓问充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力.方法:取7～10dSD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较.结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P＜0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性.在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达.第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有“矿化”结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势.结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞.
