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离心重力诱导脂肪间充质干细胞向软骨样细胞分化
目的 探讨离心重力对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)向软骨样细胞分化以及对 Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法 通过加载不同离心力(0、500、1000、2000、2500、3000 × g)和持续时间(0、15、30、45、60 min)刺激脂肪干细胞分化为软骨样细胞,并利用荧光定量 PCR 和Western blot 检测 Sox 9 基因的上调表达来筛选条件,将培养的 P3代 hADSCs 分 3 组,对照组(不干预处理)、离心重力组和 TGF-β3 组(加入 TGF-β3 成软骨诱导剂),持续培养 21 d 后,通过阿利辛蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定,DMMB 法测定胞外基质中 GAG 含量,荧光定量 PCR 测定 II 型胶原基因表达,Western blot 进一步检测对照组和离心重力组中 Sox 9、β-catenin、GSK3β 和p-GSK3β 蛋白的表达.结果 加载适的离心重力(2500 × g,30 min)刺激hADSCs 后,培养 24 h,Sox 9 的 mRNA 和蛋白表达显著上调.阿利辛蓝和苏木精-伊红染色显示,离心重力组和TGF-β3 组中软骨表达呈阳性.GAG 实验结果显示, TGF-β3 组促 GAG 分泌的能力优于离心重力组(P <0.05),荧光定量 PCR 结果表明 TGF-β3 组其 II 型胶原mRNA 表达的能力高于离心重力组(P < 0.05),Western blot结果显示,相比对照组,离心重力组中 β-catenin 和p-GSK3β 的蛋白表达水平降低,而 GSK3β 和 Sox 9 蛋白表达升高.结论 离心重力和 TGF-β3 诱导脂肪干细胞成软骨分化中的表达具有相似的能力,离心重力对 hADSCs 诱导成软骨作用与抑制 Wnt/β-catenin 信号通路有关.
关键词： 人脂肪干细胞 超重力 Sox 9转录因子类 软骨分化 -
人脂肪干细胞膜片的构建及其生物学特性初探
目的 利用分离纯化后的人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)构建ADSCs膜片,并探讨人ADSCs膜片的生物学特性.方法 收集年轻女性腹部手术皮下脂肪组织,用酶消化法成功分离纯化人ADSCs,进行流式细胞学鉴定,使用含有活性因子的完全培养基诱导构建人片后,扫描电镜观察细胞膜片组织形态,并采用qRT-PCR和ELISA检测人脂肪干细胞膜片相关促生长细胞因子及干性基因的表达水平.结果 成功分离人ADSCs,流式细胞学鉴定发现其间充质干细胞表面标记分子CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性,造血干细胞表面标记CD45分子为阴性,符合ADSCs表面分子表达特点;人ADSCs进行成脂和成骨诱导后,油红O与茜素红染色阳性,提示人ADSCs具有多向分化潜能;扫描电镜观察膜片中的细胞呈网格样叠加生长,细胞之间连接紧密;qRT-PCR检测结果 显示人ADSCs膜片中TGF-β 1、FGF2、HGF、VEGF、Col 1A1等促生长细胞因子和OCT4、NANOG等干性基因显著高表达.ELISA检测结果 显示人ADSCs膜片上清液高表达促生长细胞因子TGF-βl、FGF、HGF、VEGF.结论 我们成功利用人ADSCs诱导成人细胞膜片,该膜片可分泌更高含量的促生长细胞因子并表达更高水平的干性基因,为人ADSCs膜片应用于组织损伤修复提供了重要理论依据.
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两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞向脂肪细胞分化的比较
目的 比较两种培养基诱导人和大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)的成脂分化能力,探寻更为适宜的ADSC成脂诱导方案.方法 提取3例临床患者的脂肪干细胞(hADSCs)及出生6周大鼠的脂肪干细胞(rADSCs),将hADSCs、rADSCs分别接种于六孔板,分为未诱导组、成脂诱导Ⅰ组和Ⅱ组,分别使用普通培养基、成脂诱导培养基Ⅰ和Ⅱ,培养10 d后以油红O染色,镜下观察及检测490 nm吸光度值(A490),比较脂滴形成情况.结果 未诱导的hADSCs和rADSCs均呈成纤维细胞样生长,成脂诱导培养3d后出现脂滴;油红O染色显示,成脂诱导组脂滴呈橘红色,hADSCs和rADSCs的成脂诱导Ⅱ组形成的脂滴均明显大于诱导Ⅰ组,统计学分析显示hADSCs的成脂诱导Ⅱ组测得的A490明显高于诱导Ⅰ组(P＜0.01);而两组的rADSCs的A490无明显差异(P＞0.05).结论 hADSCs和rADSCs在两种诱导培养基中均可成脂分化,但成脂诱导Ⅱ组优予成脂诱导Ⅰ组.
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人脂肪干细胞的分离培养与鉴定
目的 探索一种体外分离培养人脂肪干细胞(hADSC)的有效方法.方法 选择健康女性5例,年龄25~45岁;无任何其他系统性疾病.对其应用抽脂术获取人脂肪组织,并用Ⅰ型胶原酶进行消化,贴壁培养,传代扩增,绘制不同代数细胞增殖曲线,诱导hADSC向成骨、成脂细胞分化,确定其分化潜能,并分别用茜素红和油红O染色进行鉴定.结果 原代hADSC第2天开始贴壁,形态呈纺锤型,类似纤维细胞,增殖较快,呈漩涡状排列.第3代至第5代hADSC生长曲线类似,都呈S形;成骨、成脂诱导2周后进行茜素红染色和油红O染色,结果都为阳性.结论 通过对抽脂术获得的人脂肪组织进行分离培养,可以得到有效的hADSC,且具有向成骨、成脂细胞方向分化的能力,可作为进一步实验研究的种子细胞.
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重组hTGF-β1基因转染人脂肪干细胞对其向软骨分化的影响
目的 研究重组hTGF-β1腺病毒(AdhTGF-β1)转染人脂肪干细胞(ADSCs)对其向软骨分化的作用.方法 重组AdhTGF-β 1转染人ADSCs,对照组转染AdLacZ,腺病毒的量以200pfu/细胞计算,体外细胞团聚集连续诱导培养21d,酶联免疫吸附定量检测(ELISA) hTGF-β 1蛋白的表达,然后分别从大体观察、组织学和Ⅱ型胶原蛋白免疫组化的检测对形成组织进行评价.结果 hTGF-β1蛋白量在14d时达高峰,随后逐渐降低.连续细胞团聚集诱导培养21d,细胞团收缩成近似小球形的组织块,外观成乳白色.HE染色可见细胞团外周为由数层扁平状成纤维样细胞组成的纤维软骨膜,下部区域有巢状软骨样细胞组成,有些区域可见软骨样细胞包埋在软骨陷窝内.Safranin'O染色显示,形成的软骨组织区域有被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌.而对照组苏木素-伊红染色观察见无软骨样组织形成或有向软骨分化现象.Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示实验组细胞团出现较明显的阳性染色区域,可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内.对照组Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示无明显的阳性染色区.结论 重组hTGF-β 1腺病毒转染人ADSCs诱导人ADSCs向软骨细胞表型分化形成软骨样组织,为hTGF-β 1基因转染的人ADSCs在软骨组织工程应用中奠定了基础.
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膨体聚四氟乙烯与人脂肪干细胞的体外生物相容性
背景：膨体聚四氟乙烯多孔高分子聚合材料是临床常用的植入假体，具有良好的生物相容性，不易变形、变质，不产生炎症吸收反应，可允许细胞游走和组织向内生长。
目的：观察人脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯材料的生物相容性。
方法：将第4代人脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯体外复合培养，采用倒置相差显微镜观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况，计算细胞黏附率，MTT比色法检测细胞增殖率。
结果与结论：刚接种的细胞呈圆形透亮，在支架材料表面分布均匀，细胞活性佳，3 h后大量细胞贴壁，24 h后可见少量呈短梭形的脂肪干细胞贴壁，3d首次换液，细胞清晰可见，低密度生长时呈短梭形或多角形，分布均匀，种植7 d后细胞数量明显增加，极少细胞从支架上掉落，细胞黏附率平均达95.7%，并且细胞仍保持正常的分裂增殖速度。说明膨体聚四氟乙烯材料具有良好的细胞相容性，可作为脂肪组织工程的种子。 -
人脂肪干细胞的提取和鉴定
背景：脂肪干细胞是存在于脂肪中的全能干细胞，具备自我更新能力与多向分化潜能，遗传背景相当稳定，体内植入后免疫排斥少，是一种比较理想的种子细胞。目的：提取人大网膜脂肪干细胞，并进行成脂和成骨分化能力鉴定。
方法：收集手术患者大网膜的脂肪组织，经Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心后进行原代培养，观察细胞生长状态；用细胞计数法绘制人脂肪干细胞增殖曲线，计算处于对数生长期的倍增时间；用相应的定向诱导液诱导人脂肪干细胞向脂肪细胞及骨细胞方向分化，并用油红O染色、茜素红染色进行鉴定。
结果与结论：从手术患者大网膜脂肪组织中成功分离人脂肪干细胞，贴壁生长的人脂肪干细胞为长梭形，形态类似成纤维细胞。第3代人脂肪干细胞生长曲线呈S形，对数生长期人脂肪干细胞的倍增时间为45.90 h。人脂肪干细胞经成脂、成骨定向诱导分化2，3周后，油红O染色显示细胞内有大小不等的橘红色脂肪滴，茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节，提示所培养的脂肪干细胞具有向脂肪细胞、骨细胞系分化的能力。 -
人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定
目的:探讨胶原酶消化法从人脂肪组织中提取脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的可行性.方法:采用胶原酶消化法将真空抽脂术抽取的新鲜脂肪组织进行消化分离,获取ADSCs并进行培养,用流式细胞术鉴定ADSCs的表面特异性标志物CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果:利用胶原酶消化法可成功提取ADSCs,其标志物CD44和CD105表达阳性,CD34为低表达,CD45表达为阴性.结论:通过胶原酶法可成功提取人ADSCs.
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EIF-GT/PCL纳米纤维电纺膜体外诱导hADSCs向表皮细胞表型转化的相关研究
目的 探讨表皮诱导因子复合体(Epidermal inducing factors,EIF)-明胶(Gelatin,GT)/聚己内酯(Polycaprolac-tone,PCL)纳米纤维电纺膜,体外诱导人脂肪干细胞(Human adipose derived stem cells,hADSCs)向表皮细胞表型转化的可行性,以及相关的生物学特性.方法 采用混合静电纺丝法制备EIF-GT/PCL纳米纤维电纺膜(实验组)和GT/PCL纳米纤维电纺膜(对照组),进行形态学观察和力学测试;通过酶联免疫吸附测定法绘制EIF-GT/PCL纳米纤维电纺膜的药物释放曲线;将hADSCs接种于两种电纺膜上进行体外培养,扫描电镜观察细胞-纳米纤维电纺膜黏附情况,CCK-8法检测细胞增殖情况,免疫荧光法检测CK10及CD105的表达情况.结果 实验组和对照组具有相似的纳米级结构,形态、密度均匀,力学特性佳;实验组能够平稳释放EIF达15 d以上;hADSCs在实验组上黏附更好,增殖更快.培养7 d后,实验组上hADSCs表达CK10,间充质干细胞标志物CD105表达减弱.结论 EIF-GT/PCL纳米纤维电纺膜具有良好的生物学特性,可诱导hADSCs向表皮细胞表型转化.
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利用PDMS微孔阵列微型反应器设计hADSCs空间堆叠模型
目的：利用微尺度技术（Micro-scale technologies）建立人脂肪干细胞（hADSCs）体外三维培养平台，观察空间堆叠状态对种植后的hADSCs增殖和凋亡的影响。方法利用光刻技术在硅晶元表面生成直径60μm、80μm、100μm和150μm的微柱状结构，经聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒模、固化生成同规格的微孔阵列（Micro-well arrays），加装PDMS环形外壁后组成微型反应器，测量、分析此实验平台的加工误差率；第3代hADSCs配制成1×105 cells/mL、6×104 cells/mL、3×104 cells/mL三种浓度单细胞悬液，并各取200μL分别接种于纯平PDMS微型反应器及直径60μm、80μm、100μm和150μm微孔微型反应器内，选择种植后24 h、72 h、120 h和168 h为采样点，对各观察组细胞分布状况进行形态学描述、细胞计数及活/死细胞检测。结果各孔径PDMS微孔阵列的微孔口径精度误差率均不超过0.2%；档hADSCs以6×104 cells/mL浓度接种时，细胞基本可以实现在150μm微孔内呈单层平铺、100μm微孔内呈2层堆叠、80μm微孔内呈3层堆叠；各微孔内细胞数在7 d内均无明显的数量变化，60μm组微孔内细胞数少且微孔外平面残留细胞多（P<0.05）；60μm组微孔内凋亡细胞比例高于其他组（P<0.05）。结论微加工倒模制作的PDMS微孔阵列培养平台误差率低，可满足高精度设计需要；hADSCs短时间（7 d）接种于微孔内处于增殖静止状态，能够保持三维堆叠状态稳定，便于进行堆叠状态下的细胞学早期研究；hADSCs在不同口径微孔内可以实现不同的堆叠层数，其凋亡比率与堆叠层数有关，堆叠层数少的细胞凋亡比例低于堆叠层数多者。
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人脂肪干细胞在骨组织工程中应用的研究进展
大面积骨缺损的修复一直是临床面临的难题.近年来,干细胞和骨组织工程研究的不断深入,为临床骨缺损的修复提供了新的思路.脂肪干细胞(Adipose-derived stem cell,ADSC)由于来源丰富且容易获取,体内、外实验均证实其能分化形成骨样组织,已成为骨组织工程的重要的种子细胞来源.本文就hADSC的免疫表型、体内成骨、成骨分化的调控及骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP2)对hADSC成骨分化的影响进行综述.
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人脂肪干细胞体外向成骨细胞定向诱导分化的实验研究
目的:探讨人脂肪干细胞(hASCs)的分离方法、体外增殖能力及定向诱导分化为成骨细胞的潜能.方法:从脂肪抽吸物中分离、培养具有多向分化潜能的脂肪干细胞,比较原代(P0)及传代第1、2、5代(P1、P2、P5)细胞的生长曲线.实验组取P2细胞.应用成骨诱导液向成骨细胞定向诱导分化,并以未诱导组为对照组,利用ALP染色,von Kossa染色、免疫荧光检测、RT-PCR等方法对细胞成骨潜能进行评价.结果:传代细胞较原代细胞增殖速度快.P1、P2、P5均具有一些共同特征,传代培养的潜伏期约为24 h,传代培养细胞的对数增殖期约为2～3 d,接种后第4～5天进入平台期;细胞诱导14d后,实验组ALP染色呈阳性反应,对照组阴性;von Kossa染色.实验组出现深棕色结节状沉积,且随诱导时间增加而加深,对照组无结节状沉积出现;免疫荧光检测,实验组和对照组均表达Ⅰ型胶原,实验组骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)检测为阳性,对照组为阴性或弱阳性;RT-PCR检测表明,实验组诱导14d时有ALP、Osteopontin表达,对照组阴性;实验组、对照组及成骨细胞均有Ⅰ型胶原阳性表达.结论:hASCs在体外培养条件下生长良好,P2细胞在诱导培养下可向成骨细胞分化,为以hASCs为种子细胞构建组织工程骨奠定了基础.
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自撑式石墨烯水凝胶诱导人脂肪干细胞成骨分化的体外研究
目的：通过体外实验评价本课题组制备的自撑式石墨烯水凝胶（self-sustaining graphene hydrogel，SGH）的骨诱导性能。方法（1）将人脂肪干细胞（hADSC）接种于 SGH 和玻片表面，采用荧光显微镜图像计数检测 ADSC 在材料表面粘附能力；通过扫描电镜观察材料本身的表征及细胞在 SGH表面生长的形态；（2）SGH 组加入普通培养液作为实验组，玻片组加入成骨培养基作为诱导组，玻片组加入普通培养液作为对照；通过实时定量荧光 PCR、ALP 活性检测和茜素红半定量测定钙沉积评价各组 hADSC 的分化及成骨能力。结果 hADSC 能以等同于在玻片表面的粘附效率和正常的形态在 SGH 表面生长。实验组细胞在不同时间点成骨相关基因的表达水平、ALP 活性以及钙盐沉积量均显著高于对照组而略低于诱导组（P ＜0．05）。结论自撑式石墨烯水凝胶作为一种生物相容性材料，具有较强的诱导人脂肪干细胞成骨分化的能力。
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RUNX2基因对于ADSCs向表皮分化的影响研究
目的 诱导人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)在体外向表皮细胞分化并探讨 RUNX2基因对 ADSCs 表皮分化的影响.方法 利用胶原酶消化法分离培养 ADSCs,体外诱导 ADSCs向表皮细胞分化.慢病毒载体介导RUNX2基因转染ADSCs并通过 Western blot、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光验证RUNX2、相关表皮细胞标记物CK18、ZO-1的蛋白和 mRNA的表达.结果 ADSCs向表皮诱导 14天后, RUNX2、CK18、ZO-1的 mRNA及蛋白的表达水平均明显高于对照组(P<0.05);过表达RUNX2慢病毒转染后的 ADSCs以上指标均显著高于对照组和阴性对照组(P<0.05).结论 RUNX2过表达可在一定程度上促进 ADSCs向表皮细胞诱导分化.
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人脂肪干细胞与聚L-谷氨酸/海藻酸钠可注射水凝胶的生物相容性研究
天然高分子聚合物聚L-谷氨酸(PLGA)与氧化海藻酸钠(OAg)共价交联合成PLGA/OAg水凝胶,将人脂肪来源干细胞(hADSCs)接种于水凝胶内,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞在支架中的存活、增殖、黏附情况,DNA定量法检测细胞的增殖.体外证实该水凝胶材料生物相容性良好,具有性能可控性和微创性等优势,对于进一步开发脂肪组织工程材料具有指导性意义.
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低强度脉冲超声对人脂肪干细胞成骨诱导影响的实验研究
[目的]探讨低强度脉冲超声在人脂肪干细胞成骨诱导中的影响.[方法]取手术患者腹部及腰背部处脂肪,采用胶原酶消化离心贴壁法分离培养脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),流式细胞仪检测细胞表面标记.第6代细胞分为四组:(1)阴性对照组:ADSCs于完全培养基中培养,不接受LIPUS刺激;(2) LIPUS组:ADSCs于完全培养基中培养,接受LIPUS刺激;(3)成骨诱导组:ADSCs于成骨诱导培养基中培养;(4) LIPUS联合成骨诱导组:ADSCs在成骨诱导培养基中培养,接受LIPUS刺激.[结果]ADSCs形态传至10代时仍无变化.流式细胞仪分析第6代hADSCs细胞表面特异性标记结果显示,CD105:99.61％,CD29:97.54％,CD45:0.26％,CD44:97.4％,CD14:2.51％.LIPUS+诱导组的碱性磷酸酶(ALP)表达明显高于其他组,而单用LIPUS,并不能促进成人脂肪干细胞成骨分化.[结论] LIPUS可以促进成骨诱导培养基培养下的成人脂肪干细胞的成骨分化.
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镁黄长石浸提液促进人脂肪干细胞体外成骨分化的机制研究
目的:探讨镁黄长石浸提液促进人脂肪干细胞成骨分化的机制.方法:分离培养人脂肪干细胞,制备镁黄长石浸提液母液及浓度为1％和10％的镁黄长石浸提液.采用体外培养的第3代人脂肪干细胞分别进行以下实验:①将接种于镁黄长石生物陶瓷材料上的第3代人脂肪干细胞分为2组,A组以生长培养液培养、B组以生长培养液+成骨诱导液培养.分别于培养开始前及培养开始后1、4、7d和10 d提取培养液的上清液,采用电感耦合等离子体-原子发射光谱技术测定Ca、Mg、Si离子的浓度.②采用镁黄长石浸提液母液+成骨诱导液培养第3代人脂肪千细胞,分别在培养开始后1、4、7、10、14、17、21 d以Western Blot法检测细胞的细胞外调节蛋白激酶和磷酸化细胞外调节蛋白激酶的表达情况,同时在培养开始后4、10、14、17 d测定碱性磷酸酶含量.③将培养的第3代人脂肪干细胞分为4组,Ⅰ组以生长培养液+成骨诱导液培养、Ⅱ组以1％镁黄长石浸提液+成骨诱导液培养、Ⅲ组以10％镁黄长石浸提液+成骨诱导液培养、Ⅳ组以镁黄长石浸提液母液+成骨诱导液培养.培养至第10天时,以Western Blot法检测4组细胞的细胞外调节蛋白激酶和磷酸化细胞外调节蛋白激酶的表达情况,并测定碱性磷酸酶定量含量.结果:①人脂肪干细胞体外培养过程中镁黄长石析出离子浓度.培养过程中不同时间点的Ca离子浓度不同(P =0.001)；2组Ca离子浓度总体有差别(P =0.001),进一步比较,A组各时间点Ca离子浓度均高于B组[0 d:(1.65±0.03) mmol·L-1,(1.51±0.01)mmol· L-1,P=0.001;1 d:(4.78±0.18)mmol· L-1,(2.56±0.02) mmol· L-1,P =0.001;4 d:(3.27±0.11)mmol · L-1,(1.90±0.01) mmol· L-1,P =0.001;7 d:(3.24±0.03) mmol·L-1,(2.03±0.02)mmol· L-1,P =0.001;10 d:(3.14±0.02) mmol·L-1,(2.13±0.03) mmol ·L-1,P=0.000]；时间因素与分组因素存在交互效应(P=0.001).培养过程中不同时间点的Mg离子浓度不同(P =0.001)；2组Mg离子浓度总体有差别(P=0.001),进一步比较显示,除0d外,其余各时点A组Mg离子浓度均高于B组[0 d:(0.09 ±0.00) mmol· L-1,(0.09±0.叭)mmol· L-1,P=0.407;1 d:(0.46±0.02) mmol· L-1,(0.27±0.01) mmol· L-1,P =0.001;4 d:(0.27±0.01)mmol· L-1,(0.13±0.01)mmol· L-1,P =0.001;7 d:(0.26±0.01) mmol· L-1,(0.18±0.02)mmol ·L-1,P=0.001；10 d:(0.24±0.01) mmol·L-1,(0.17±0.01) mmol·L-1,P =0.001]；时间因素与分组因素存在交互效应(P=0.001).培养过程中不同时间点的Si离子浓度不同(P=0.001)；2组Si离子浓度总体有差别(P=0.001),进一步比较,除0d外,其余各时点A组Si离子浓度均高于B组[0 d:(0.01±0.00) mmol·L-1,(0.01±0.00) mmol·L-1,P=1.000;1 d:(2.52±0.02) mmol·L-1,(2.05±0.06)mmol· L-1,P =0.001;4 d:(1.71 ±0.01)mmol· L-1,(0.53 ±0.01) mmol· L-1,P =0.001;7 d:(1.91±0.01)mmol· L-1,(1.14 ±0.01) mmol· L-1,P =0.001;10 d:(1.88±0.01) mmol· L-1,(1.24±0.01)mmol· L-1,P=0.001]；时间因素与分组因素存在交互效应(P=0.001).②镁黄长石浸提液作用时间对人脂肪干细胞成骨分化的影响.磷酸化细胞外调节蛋白激酶在第7天开始表达,第10天和第14天时表达量高,第17天时表达量又降至基础水平.第4天、第10天、第14天、第17天ALP含量比较,差异有统计学意义[(3.68±0.80)nmol PNP· min-1 · mg-1,(7.90±0.50)nmol PNP· min-1·mg-1,(7.79±0.53) nmol PNP·min-1 ·mg-1,(6.93±0.86) nmol PNP·min-1·mg-1；P =0.000].进一步两两比较,第4天时ALP含量低于其余3个时间点(P=0.000),其余各时点两两比较,差异均无统计学意义.③镁黄长石浸提液浓度对人脂肪干细胞成骨分化的影响.体外培养至第10天时,各组细胞的细胞外调节蛋白激酶表达量基本相同,而磷酸化细胞外调节蛋白激酶的表达量略有差异,其中Ⅱ组表达量高.各组细胞ALP含量比较,差异有统计学意义[(5.26±0.25) nmol PNP·min-1·mg-1,(5.76±0.15)nmol PNP· min-1·mg-1,(5.32±0.20) nmol PNP· min-1·mg-1,(5.32±0.25) nmol PNP· min-1· mg-1;P=0.024].进一步两两比较,Ⅱ组含量高于其余3组(P=0.010,P=0.020,P=0.007),其余各组两两比较,差异均无统计学意义.结论:镁黄长石浸提液可以促进人脂肪干细胞成骨分化,且具有浓度依赖性,其机制可能与镁黄长石析出的Ca、Mg、Si离子激活细胞外调节蛋白激酶转导通路有关.
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盐酸法舒地尔在脂肪干细胞向表皮细胞诱导分化中的作用
目的 探讨盐酸法舒地尔(HA1077)在脂肪干细胞(ADSC)向表皮细胞诱导分化中的作用.方法 用酶消化法消化人脂肪组织获取ADSC,以基础培养基即体积分数含10％胎牛血清的DMEM培养基传代,取生长良好达到90％融合的第3代人ADSC分为4组,第1组持续用基础培养基培养、传代；将第2、3、4组弃基础培养基,无菌磷酸盐缓冲溶液冲洗,分别换用培养液2(基础培养基+20 μmol·L-1 HA1077)、培养液3(体积分数70％的基础培养基+体积分数30％的成纤维细胞培养基上清液+10 ng·L-1重组人表皮生长因子)、培养液4(20 μmol·L-1 HA1077+培养液3),诱导后经免疫细胞化学、流式细胞仪检测CK19的表达.结果 免疫细胞化学分析表明ADSC表达CD44、CD49d,而不表达CD106、CD34、CK19；流式细胞仪检测CD44、CD49d的阳性率分别为(98.84±0.02)％、(92.52±0.04)％.流式细胞仪检测各组CK19的表达阳性率分别为(0.23±0.01)％、(0.35±0.02)％、(9.73±0.80)％、(17.65±1.00)％,其中第3、4组CK19的阳性率较对照组明显增高,差别均有统计学意义(P＜0.05).结论 HA1077对ADSC向表皮细胞诱导分化有促进作用.
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胰高血糖素样肽-1对人脂肪干细胞增殖、成脂分化及脂代谢的影响
目的 研究胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对人脂肪干细胞(ASCs)增殖、成脂分化及脂代谢的影响.方法 胶原酶分离法原代培养人ASCs,体外扩增及传代建立稳定的培养体系.用含有不同浓度GLP-1(0、0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L)的基础培养基和成脂分化培养基培养细胞,噻唑蓝法(MTT)检测干预24、48及72 h后细胞增殖情况,分化21d后行油红O染色、异丙醇萃取法检测细胞内脂质含量,同时测定分化过程中上清液中甘油释放量作为脂质分解的指标,测定细胞裂解液中三酰甘油的含量作为脂质合成指标.结果 ①高浓度的GLP-1(100.0 nmol/L)对人ASCs的增殖具有抑制作用,且随着时间的延长抑制作用更明显.②油红O染色及异丙醇萃取法显示100.0 nmol/L的GLP-1抑制人ASCs的成脂分化.③在人ASCs成脂分化过程中,高浓度的GLP-1(100.0 nmol/L)可促进甘油的释放,而对细胞内三酰甘油的含量影响不大.结论 高浓度GLP-1可抑制人ASCs的增殖及成脂分化,促进脂质分解,对脂质合成无明显作用.
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Ⅰ型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究
目的 观察人脂肪干细胞与I型胶原支架材料的生物相容性,为脂肪组织工程选择适宜的种子细胞载体.方法 将人脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架体外培养复合,采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长及增殖情况并计算细胞黏附率,XTT比色法检测细胞增殖率.结果 脂肪干细胞能良好的在支架上黏附、生长和增殖.结论 Ⅰ型胶原支架材料具有良好的细胞相容性,可作为脂肪组织工程的种子细胞载体.
