蛋白酶体抑制剂ALLN促进α-synuclein转染SH-SY5Y细胞内包涵体形成

目的研究蛋白酶体功能障碍在帕金森病发病机制中的作用.方法采用蛋白酶体抑制剂ALLN(N-acetyl-Leu-Leu-Norleucinal)处理α-synuclein转染的体外培养SH-SY5Y细胞.HE染色和免疫荧光细胞化学检测转基因表达产物在细胞内的积聚,TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果α-synuclein可在细胞内自发蓄积形成包涵体,ALLN可明显促进包涵体形成;该包涵体呈α-synuclein免疫反应阳性而泛素免疫反应阴性;含有包涵体的细胞可同时表现为TUNEL反应阳性.结论蛋白酶体功能障碍可能在帕金森病发病过程中发挥重要作用.

α-synuclein对神经递质释放的调节与帕金森氏病发展的关系研究

帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)是一种在中、老年人群中常见神经系统退行性疾病,其病因主要包含年龄老化、遗传因素和环境因素三个方面,尤其是遗传因素的影响,引起研究者极大关注,其中α-synuclein在PD发生过程中的作用得到了广泛研究,但其具体机制仍未阐明.在PD发病机制的研究中,多巴胺等多种神经递质释放及重摄取的改变是重要假说之一.近几年研究发现α-synuclein可以通过促进突触前膜SNARE复合物装配,调节多巴胺代谢,维持多巴胺稳态等途径影响PD患者脑内神经递质的释放及含量.本综述将从此角度入手,探讨α-synuclein与PD的关系.

二苯乙烯苷对过度表达α-synuclein蛋白的转基因COS-7细胞株的影响

目的 观察二苯乙烯苷(TSG)在体外试验中对COS-7细胞株过度表达α-synuclein蛋白的影响.方法 将不同浓度的TSG与转染α-synuclein基因的COS-7细胞共孵育24 h,应用二甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,免疫细胞化学和Western免疫印迹法检测α-synuclein蛋白的表达,观察TSG对其的影响.结果 TSG在12.5～200.0 μmol/L浓度范围内与COS-7细胞孵育24 h不影响细胞存活率,而在免疫细胞化学和Western免疫印迹分析中均显示TSG剂量依赖性地抑制α-synuclein蛋白表达和聚集.结论 TSG在体外对COS-7细胞过度表达α-synuclein有明显抑制作用.

鱼藤酮诱导细胞内泛素化α-synuclein聚集选择性损伤多巴胺神经元

目的 探讨鱼藤酮对多巴胺能神经元内泛素化α-synuclein聚集的影响及其细胞损伤作用.方法 应用鱼藤酮处理经NGF诱导的神经元样分化的PC12细胞株(多巴胺能神经元)与N2a细胞株(非多巴胺能神经元)4、8、16、24 h以及用利血平预处理PC12细胞4 h再加入鱼藤酮处理16 h;采用免疫荧光双标记方法在共聚焦显微镜下观察细胞内泛素化α-synuclein聚集, 以MTT法和流式细胞术分别检测PC12细胞活力及凋亡率.结果 单用鱼藤酮处理16 h后,PC12细胞株与N2a细胞株相比较,免疫荧光双标记显示PC12细胞内泛素化α-synuclein发生明显聚集,并且鱼藤酮对PC12细胞株的作用具有时间依赖性,而N2a细胞内泛素化α-synuclein聚集不明显.利血平耗竭PC12细胞内多巴胺后再经鱼藤酮处理,PC12细胞内泛素化α-synuclein聚集不明显;经不同浓度鱼藤酮处理后,细胞活力呈剂量依赖性下降;与对照组相比,经20 nmol/L鱼藤酮处理4、16、24 h后细胞存活率分别为(81.6±12.3)%、(59.8±6.7)%和(52.2±7.4)%(P＜0.01).鱼藤酮处理后出现早期凋亡细胞,随着处理时间的延长细胞凋亡率逐渐上升(P＜0.01).结论 鱼藤酮选择性作用于多巴胺能神经元,使细胞内泛素化α-synuclein发生聚集,而且这种变化具有时间依赖性,终导致细胞发生凋亡,然而鱼藤酮对非多巴胺能神经元作用不明显.同时,鱼藤酮诱导泛素化α-synuclein发生聚集的作用与神经元的特性存在密切关系.

家族性帕金森病的基因研究进展(综述)

回顾了近年来家族性帕金森病(Parkinson disease ,PD)的基因研究新进展.第4号染色体长臂上的α-synuclein基因在第4号外显子上的1 个错义点突变(G209A),导致其编码的氨基酸序列上的53位氨基酸由丙氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr,A53T),从而发生聚集、缠绕和纤维化,致使多巴胺神经元死亡.青年型PD综合征与第6号染色体长臂6q25.2-27之间的一个称为Parkin的基因密切相关,其第3～7号外显子的不规则缺失突变,导致Parkin丧失运输有缺陷的或已失活蛋白的能力,还有可能导致其丧失细胞生长、分化和发育的调控功能,终表现为多巴胺神经元死亡和缺失;对位于第2号染色体短臂上的Park3基因的研究,虽然其具体机制不清楚,但可能为散发性PD的研究提供一些启示.

Both genetic and environmental factors are important in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Asα-synuclein is a major constituent of Lewy bodies, a pathologic hallmark of Parkinson’s dis-ease, genetic aspects ofα-synuclein is widely studied. However, the inlfuence of dietary factors such as quercetin onα-synuclein was rarely studied. Herein we aimed to study the neuropro-tective role of quercetin against various toxins affecting apoptosis, autophagy and aggresome, and the role of quercetin onα-synuclein expression. PC12 cells were pre-treated with quercetin (100, 500, 1,000 μM) and then together with various drugs such as 1-methyl-4-phenylpyridin-ium (MPP+; a free radical generator), 6-hydroxydopamine (6-OHDA; a free radical generator), ammonium chloride (an autophagy inhibitor), and nocodazole (an aggresome inhibitor). Cell viability was determined using a 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltertazolium bromide (MTT) assay. Apoptosis was detected by annexin V-lfuorescein isothiocyanate and propidium iodide through the use of lfuorescence activated cell sorter.α-Synuclein expression was detected by western blot assay and immunohistochemistry. The role of α-synuclein was further studied by knocking outα-synuclein using RNA interference. Cell viability increased at lower concen-trations (100 and 500 μM) of quercetin but decreased at higher concentration (1,000 μM). Quercetin exerted neuroprotective effect against MPP+, ammonium chloride and nocodazole at 100 μM. MPP+ induced apoptosis was decreased by 100 μM quercetin. Quercetin treatment in-creasedα-synuclein expression. However, knocking outα-synuclein exerted no signiifcant effect on cell survival. In conclusion, quercetin is neuroprotective against toxic agentsvia affecting var-ious mechanisms such as apoptosis, autophagy and aggresome. Becauseα-synuclein expression is increased by quercetin, the role of quercetin as an environmental factor in Parkinson’s disease pathogenesis needs further investigation.

钾通道在MPP+诱导的α-synuclein转基因细胞凋亡中的作用

目的 帕金森氏病(PD)的主要病理表现为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性死亡,为了揭示帕金森氏病中多巴胺能神经元死亡的机制,我们研究了钾离子通道在MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶)诱导的野生型及α-synuclein转基因SH-SY5Y细胞死亡中的作用.方法 MPP+孵育野生型及转染A53T突变型α-synuclein基因的SH-SY5Y细胞,或提前孵育钾离子通道抑制剂,全细胞膜片钳技术观察钾电流的改变.结果 ①MPP+可以诱导野生型及转染α-synuclein基因的SH-SY5Y细胞中延迟整流钾电流[IK(DR)]的增加,并且在α-synuclein转基因细胞中IK(DR)的增加更显著;②MPP+孵育野生型及转染α-synuclein的SH-SY5Y细胞6 h即可诱导Ik电流的增加,24～48 h Ik电流增加加剧:③四乙铵(TEA)可以抑制MPP+诱导的野生型和α-synuclein转基因SH-SY5Y细胞中钾电流的增加.结论 钾离子通道的开放及延迟整流钾电流的增加在MPP+诱导的帕金森氏病细胞模型中发挥重要作用,为揭示PD中多巴胺能神经元的凋亡提供了新的思路.

抗人α-synuclein多克隆抗体的制备和鉴定

制备特异性抗人α-synuclein抗血清,用于α-synuclein相关退行性疾病及病理状态的研究. 用重组人α-synuclein免疫BALB/C小鼠,Dot blot、Western blot及免疫组化法鉴定所获抗血清. Dot blot显示该抗血清可识别高于50 ng的重组α-synuclein.Western blot分析表明此抗血清可识别人及大鼠脑匀浆中相对分子质量为1.8万的蛋白质,与以往报道α-synuclein的相对分子质量一致.免疫组化染色显示α-synuclein免疫活性物质广泛分布于皮质、海马、纹状体、杏仁核和嗅球,主要集中于神经元核周胞质及神经末梢.提示:所制备的抗血清可特异性识别人及大鼠脑中的α-synuclein, 该抗体对α-synuclein相关疾病的研究具有应用价值.

α-Synuclein与MPP+细胞毒性协同作用的研究

目的 模拟与帕金森病发病密切相关的遗传因素与环境因素,研究α-synuclein与MPP+对细胞的毒性作用.方法 RT-PCR方法扩增α-synuclein基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染;Western blot,MTT方法,双报告基因检测法和显微镜观察,研究过表达α-synuclein和MPP+对细胞存活率及NFκB信号通路的影响.结果 MPP+和α-synuclein均能够显著抑制细胞存活率,二者共同作用时抑制作用更加明显;而且研究发现α-synuclein能够抑制由转录因子NFκB介导的基因表达,MPP+能够进一步增强其抑制作用.结论 在遗传背景发生改变时,细胞对外界环境中的毒素更加敏感,提示帕金森病的发病存在某种遗传易患性.

G蛋白偶联受体激酶5在稳定表达α-Synuclein的SHSY5Y细胞中的基因表达调控功能

目的 观测G蛋白偶联受体激酶5(G protein-coupled receptor kinase, GRK5)在稳定表达hα-synuclein(人突触核蛋白)的SHSY5Y细胞的胞核、胞浆中的表达情况并对其在帕金森病中的可能作用进行研究.方法应用Western blotting、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)活性检测技术以及shRNA干扰技术等对稳定表达hα-synuclein的SHSY5Y细胞中GRK5的表达及其亚细胞分布、胞核内GRK5蛋白的功能进行研究.结果 发现GRK5蛋白在过表达hα-synuclein的细胞核以及细胞浆内均表达增加,胞核中的GRK5蛋白通过影响组蛋白去乙酰化酶的活性对bcl-2基因的转录和表达进行调控.结论 帕金森模型中GRK5通过对bcl-2基因的表达进行调控发挥作用.

野生型及突变型α-synuclein转基因表达载体的构建

目的构建中枢神经系统特异表达的野生型及突变型α-synuclein转基因表达载体.方法通过PCR方法扩增α-synuclein基因,产物亚克隆到pGEM-T载体,经测序无误后克隆到pCEP4载体,并用神经特异的PDGF启动子替代pCEP4载体的CMV启动子构建野生型转基因表达载体.利用大引物突变法构建A53T和A30P的转基因表达载体.结果通过限制性内切酶及DNA测序证实野生型及突变型α-synuclein均成功的克隆到所需要的载体中.结论该转基因表达载体的成功构建为帕金森氏病转基因动物的构建及帕金森氏病发病机制的研究奠定基础.

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型的建立

目的 建立人α-Synuclein野生型及两个突变型A53T和A30P基因的转基因动物模型,研究α-Synuclein在帕金森病发病过程中的作用.方法 构建人α-Synuclein表达载体,利用显微注射法制备人α-Synuclein基因的转基因小鼠.通过PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型.通过RT-PCR和Western blotting方法鉴定转基因小鼠脑组织中人α-Synuclein mRNA和蛋白表达情况.采用免疫组化鉴定人α-Synuclein在小鼠脑组织中的表达情况.通过Rotating rod实验评价转基因小鼠的行为改变情况.结果 得到表达水平不同的野生型人α-Synuclein转基因小鼠2个品系.得到表达水平不同的A53T突变型α-Synuclein转基因小鼠2个品系.得到表达水平不同的A30P突变型α-Synuclein转基因小鼠3个品系.免疫组化显示,转基因小鼠大脑海马、新皮层、纹状体区出现人α-Synuelein阳性标记的细胞.Rotating rod实验结果显示转基因小鼠表现出明显的进行性运动能力障碍.结论 建立了转人α-Synuclein基因的帕金森病小鼠模型.

脑组织特异表达S100B转基因小鼠的建立

目的 S100B在多种神经损伤性疾病中高表达,高浓度的S100B蛋白对中枢神经系统具有毒性作用.建立脑组织特异表达S100B转基因小鼠,用于研究该基因在帕金森病(Parkinson's disease,PD)发病中的作用.方法 ELISA法检测S100B蛋白在α-synuclein A53T转基因小鼠脑组织中的表达情况.构建PDGF-hS100B表达载体,显微注射法建立S100B转基因小鼠.PCR鉴定转基因鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平.Rota-rod实验检测S100B转基因鼠的运动协调能力.结果 S100B在9月龄和12月龄α-synuclein A53T转基因小鼠脑组织中的表达高于野生型小鼠.建立了2个品系的脑组织特异表达S100B转基因小鼠.与野生型小鼠相比S100B转基因小鼠表现出明显的进行性运动协调能力障碍.结论 S100B转基因小鼠的建立为研究该基因在PD中的作用提供了工具.

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型中G蛋白偶联受体激酶5的表达

目的 观测G蛋白偶联受体激酶5 (G protein-coupled receptor kinase, GRK5) 在帕金森病α-synuclein转基因小鼠模型中的表达变化情况,了解GRK5在帕金森病中的可能作用,为发现帕金森病发病机制和探索更好的治疗方法提供新的方向.方法采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术对具有不同的人alpha synuclein(h-α-syn)表达水平的帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠以及3月龄,6月龄以及9月龄A53T突变型帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠脑组织进行GRK5的RNA和蛋白水平检测,与同窝阴性对照小鼠进行比较.结果各组帕金森病α-synuclein转基因小鼠与阴性对照小鼠相比,GRK5蛋白表达水平均有不同程度的增加,并且随着转入的h-α-syn蛋白表达水平的高低而有所变化.3月龄和6月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平没有变化;而9月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平都有所增加.结论帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠具有更高表达水平的GRK5.

DJ-1,α-Synuclein基因对帕金森病氧化应激作用的机制

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,尽管其确切的发病机制还不清楚,但是许多证据提示,氧化应激可能在其发病过程中起重要的作用.

α-synuclein与蛋白降解系统的相互作用关系

α-synuclein是路易小体的重要组成部分，与帕金森病（PD）有密切的关系。然而，α-synuclein在神经元内的降解方式仍然有争议，本文主要研究α-synuclein的主要降解通路及其对蛋白降解系统的影响，以期为治疗帕金森提供新的治疗策略。

siRNA干扰SIAH对细胞活性和α-synuclein泛素化降解通路的影响

目的：研究siRNA干扰SIAH基因对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞α-synuclein泛素化、降解通路的影响。方法：用荧光标记的siRNA-FAM转染SH-SY5Y细胞后，专业设计合成3条针对SIAH的siRNA， Western Blot检测蛋白水平SIAH表达的变化，筛选出其中高效的1条siRNA，用CCK-8法检测该siRNA-SIAH干扰SH-SY5Y细胞活性；流式细胞技术检测该siRNA-SIAH干扰SH-SY5Y细胞凋亡的影响；Western Blot检测α-synuclein、LC3、E1、P53蛋白水平表达的变化；qRT-PCR检测SIAH、α-synuclein、LC3、E1 mRNA水平表达的变化；免疫共聚焦分别检测SIAH、α-synuclein、LC3共定位情况。结果：3条siRNA均成功转染SH-SY5Y细胞，流式细胞术检测siRNA转染SH-SY5Y细胞转染率89%，Western结果显示其中siRNA-2#使细胞中SIAH蛋白表达明显降低，选取该序列进行研究。CCK-8法结果显示该siRNA干扰SIAH后对SH-SY5Y细胞活增高，流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰SIAH可抑制SH-SY5Y细胞的凋亡，与空白对照组、阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。通过Western Blot检测siRNA-2#组的α-synuclein、LC3、P53蛋白水平，与空白对照组、阴性对照组比较均明显降低，E1蛋白水平增高，差异均有统计学意义（P<0.05）。通过qRT-PCR检测siRNA-2#组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ mRNA水平与空白对照组、阴性对照组比较均明显降低，而E1的mRNA水平明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：应用siRNA干扰SIAH基因，通过促进泛素-蛋白酶体系统作用减少SH-SY5Y中α-synuclein聚集，SIAH基因有可能成为帕金森病治疗中的一个新靶点。

帕金森病研究中iPSCs疾病模型的选择和应用

帕金森病是一类以黑质多巴胺能神经元的进行性变性为特点的运动性疾病,在以往对帕金森病的研究中,由于缺乏对患者特异性的多巴胺能神经元的认识,阻碍了人们对疾病机制的认识和药物的研发.诱导性多潜能干细胞的出现弥补了这一缺陷,将人们对帕金森患者黑质多巴胺能神经元易损性和疾病的治疗研究推进到一个更崭新的发展阶段.

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

[目的]构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础.[方法]设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoli.DH5(大肠杆菌),大量扩增重组质粒.试剂盒纯化重组质粒.用LipofectamineTM2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达. [结果]pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Western blotting检测融合蛋白分子量为47 kd,符合预期值.[结论]成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-synuclein.

蛋白质构象病与帕金森病关系研究进展

帕金森病是常见的中枢神经系统退行性疾病,以黑质和纹状体多巴胺能神经元进行性缺失及α-synuclein聚集和Lewy小体的形成为主要特点,其确切的病因及发病机制尚不清楚.近年发现蛋白质的构象发生改变可以导致一些所谓的蛋白质构象病,蛋白质结构改变与疾病的关系已成为分子生物学新的研究前沿,蛋白质构象发生改变在帕金森病发病中的作用越来越受到人们的关注.本文就帕金森病相关蛋白质构象发生改变机制及其之间的相互关系及对帕金森病发病过程的影响研究进展进行综述.