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大鼠坐骨神经去细胞基膜管的组织形态学研究
目的:观察采用化学萃取法和反复冻融法制备大鼠坐骨神经去细胞基膜管的组织形态学变化.方法:雌性Sprague-Dawley鼠坐骨神经16条随机分为化学萃取法(chemical extracted nerve,CEN)和冻融法(freeze-thawed nerve,FTN)两组,每组18条.分别予Trinton-100化学萃取、-196℃～20℃反复冻融处理后,光镜、电镜观察其组织、形态学变化.结果:(1)CEN组基膜管管壁完整、贯通,无细胞结构,可见管状神经轮廓.(2)FTN组基膜管管壁破损、管腔堵塞,轴突、髓鞘、雪旺细胞及小血管变性、坏死,可见大量细胞碎片.结论:两种方法均能保持周围神经正常的三维空间结构,CEN制备的周围神经去细胞基膜管更具有组织形态学优势.
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大鼠脊髓去细胞支架化学萃取方法的初步探讨
脊髓损伤是脊柱外科常见疾病,制备脊髓去细胞支架,获得大然的脊髓基质和三维结构,构建组织工程化脊髓,可能有助于改变目前脊髓损伤治疗效果不理想的现状.应用化学萃取的方法可有效制备同种异体外周神经去细胞支架,而且不出现宿主免疫排斥反应[1-2].本研究采用Sondeli等[3]报道的方法萃取大鼠脊髓,观察其形态学变化特点,为制备具有天然脊髓结构的组织工程化脊髓提供理论依据.
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玻璃化法与化学萃取法制备同种异体肌腱的生物学性能比较
目的 比较玻璃化法与化学萃取法制备同种异体肌腱的生物学性能.方法 选取6个月月龄白色健康雄性来亨鸡48只,随机分为3组,每组16只.A组(玻璃化组)、B组(化学萃取组)和C组(空白对照组),分别进行组织形态学观察、生物力学测试和免疫原性检测.结果 (1)两种方法制备的肌腱与空白对照组肌腱在长度和横截面积上无明显变化,其外在结构保持一致.A、C组肌腱在细胞数目、大小及形态方面相似,B组肌腱几乎无腱细胞残存;(2)3组间的拉伸断裂强度(Pmax)、拉伸断裂功耗(Wmax)和拉伸断裂延伸率(&max)的结果差异无统计学意义(P>0.05);(3)3组间1、2周末CD+4、CD+8T淋巴细胞含量及CD+4/CD+8的比值差异有统计学意义(P<0.05);3、6周末A、B组间CD+4、CD+8T淋巴细胞含量及CD+4/CD+8的比值差异无统计学意义(P>0.05),AC、BC组间差异有统计学意义(P<0.05).结论 玻璃化法较化学萃取法制备的肌腱保留了部分原有肌腱细胞;玻璃化法和化学萃取法制备的肌腱明显降低了肌腱的免疫原性,均保留了良好的生物力学性能.
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化学法制备猕猴去细胞同种异体神经支架
目的:应用化学萃取法制备的同种异体神经移植物存小动物及低等哺乳类动物实验中取得良好的效果,但在萃取猕猴粗大、长段周围神经方面尚末形成标准化程序.目的:研究猕猴化学去细胞同种异体神经制备方法,以期获得低免疫反应的同种异体神经移植物.设计、时间及地点:观察实验,于2003 01/09在中山大学动物实验中心完成.材料:取2.5岁,3.5 kg左右,雄性健康猕猴2只,由广州九佛动物研究中心提供.方法:取4段长5 cm,直径3.5～4.0 mm的坐骨神经,以4%triton-100和4%脱氧胆酸钠溶液按一定浓度和程序进行萃取,萃取神经及未萃取神经于中段取材,行苏木精-伊红染色,纤维素染色,砂罗铬花青染色,S-100免疫组织化学染色,在扫描电镜及透射电镜下舰察超微结构.主要观察指标:神经的组织学及形态学观察.结果:萃取2次后的去细胞神经具有良好的黏性和弹性,细胞和髓鞘被彻底清除,神经纤维支架被保留,成为一种没有细胞髓鞘及其碎片的空的基底膜管架结构.而萃取1次不能完全去除抗原成分,萃取3次则破坏神经纤维支架.结论:应用4%triton-100及4%脱氧胆酸钠萃取2次,可去除猕猴长段、粗人周围神经中的细胞和髓鞘而保留神经的基底膜管和纤维支架结构.
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去细胞同种异体神经种植许旺细胞的体外实验:组织工程化人工神经应用的可行性
目的:许旺细胞作为种子细胞在组织工程化人工神经制备中的作用已被学术界所接受.胎兔的神经系统已发育完善,而免疫系统尚未成熟,探讨将胎兔许旺细胞植入去细胞同种异体神经桥接体制备组织工程化人工神经修复周围神经缺损的可行性.方法:实验于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院完成.①实验材料:SPF级怀孕28 d的新西兰白兔2只、成年新西兰白兔1只.②实验过程:包括胎兔许旺细胞培养、去细胞神经桥接体的制备以及许旺细胞与去细胞神经桥接体的体外种植3个步骤.使用双酶消化法培养许旺细胞并将其种植于经3%TritonX-100作用96 h后的同种异体神经中.③实验评估:分别于培养的1,3,5 d通过石蜡切片苏木精-伊红染色观察许旺细胞在桥接体中的生长情况.结果:①采用双差速贴壁法去除绝大部分成纤维细胞后在细胞培养的初期使用阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长,后期培养液中加入神经生长冈子促进许旺细胞牛长能获取大量许旺细胞且纯度可达90%以上.②用3%Triton X-100作用96 h可去除周围神经中的细胞和髓鞘而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构,并且对神经基底膜主要成分一层粘连蛋白无明显影响.③采用胎兔坐骨神经培养的许旺细胞能在用成年兔坐骨神经制备的去细胞桥神经接体中生长良好,并且有迁移成行的特性.结论:种植许旺细胞重新细胞化的去细胞同种异体神经将可能成为一种理想的组织工程化人工神经.
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不同方法制备移植修复材料对异体肌腱生物学性能的影响
背景：移植的肌腱必须具有良好的生物力学性能，才能有效避免缝合时肌腱吻合端的撕裂，减轻肌腱愈合过程中粘连程度。目的：探讨移植修复材料不同制备方法对异体肌腱生物学性能的影响。方法：将48只健康雄性来亨鸡依据随机数字表法分为均分为3组，切取3组鸡一侧第三趾屈趾浅深肌腱，玻璃化组、化学萃取组分别采用玻璃化法与化学萃取法处理肌腱，空白对照组肌腱不做任何处理。取3组一部分肌腱进行生物力学检测；另一部分进行异体移植，移植1，2，3，6周检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数。结果与结论：玻璃化法可保留部分原有肌腱细胞，化学萃取法不能。3组肌腱拉伸断裂强度、拉伸断裂功耗及拉伸断裂延伸率比较差异无显著性意义(P >0.05)。移植后1，2周末，3组间CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较差异有显著性意义(P <0.05)；移植后3，6周末，玻璃化组、化学萃取组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均明显少于空白对照组(P<0.05)，玻璃化组和化学萃取组间CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较差异无显著性意义(P>0.05)。表明采用玻璃化法和化学萃取法在有效保留肌腱生物力学性能的基础上，可显著降低肌腱的免疫原性。
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化学萃取的异种神经修复神经缺损的可行性研究
目的 探讨联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法,对异种神经移植段进行脱细胞处理,构建异种神经去细胞基质膜管,应用于修复周围神经缺损的可行性.方法 取新鲜兔坐骨神经,切成长10mm的神经段,用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)反复处理新鲜的兔神经段构建成异种神经去细胞基质膜管,修复大鼠坐骨神经缺损.结果 4个月后异种神经基质膜管与大鼠坐骨神经缝合处愈合良好,未见有神经瘤及粘连,HE染色显示异种神经基质膜管组桥接处再生神经结构连续性良好,移植段可见神经纤维及新生的血管.S-100免疫组织化学染色可见阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状.电镜超微结构观察可见再生的神经纤维较粗大,排列紧密,呈均匀一致圆型或椭圆型,髓鞘较厚,轴突结构完整.结论 联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法构建的异种神经去细胞基质膜管可以修复大鼠坐骨神经缺损.
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聚氧乙烯辛烷基酚制备去细胞神经移植体
目的 采用聚氧乙烯辛烷基酚(Triton X-100)去除周围神经中的雪旺细胞和髓鞘,制取天然神经细胞外基质,构建组织工程化神经移植体.方法 健康新西兰大耳白兔30只,分别自梨状肌下缘水平以远切取10 mm双侧坐骨神经60根,随机分为A(12h组)、B(24 h组)、C(48 h组)、D(96 h组)、E(1 w组)用于化学萃取,F(新鲜神经)为对照组.5组神经Triton X-100萃取时间分别为12 h、24 h、48 h、96 h、1 w.在新鲜神经和萃取后的神经中段分别切取1段2 mm神经,10％甲醛固定,常规石蜡包埋、纵形切片,行HE染色、磷钨酸苏木素(PTAH)染色、阿尔辛蓝(Alcian blue)染色、层黏连蛋白(Laminin)免疫组化染色.在光镜下对各组神经进行观察.结果 光镜下对各组神经进行观察,新鲜神经可见雪旺细胞分布均匀,髓鞘、基底膜排列整齐.随着萃取时间的延长雪旺细胞、髓鞘逐渐减少,髓鞘与基底膜的界限不清,至96 h时神经雪旺细胞、髓鞘消失,纵切片上基底膜呈栅栏样排列,膜与膜之间为中空结构的基底膜管,萃取时间至1 w时,基底膜仍清晰,但由胶原纤维构成的管状结构排列疏散,不规则,部分有断裂.扫描电镜下观察,随着萃取时间延长,神经内的轴突、髓鞘逐渐减少,萃取时间至96 h时神经内的轴突、髓鞘已被完全去除,可见由胶原纤维构成的立体管状结构,胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征,管内并可见膜样结构.萃取时间为1 w时,由胶原纤维构成的立体管状结构与96 h的标本相似,但结构较之稍散乱,形成的管腔不规则.A～F组切片单位面积Lamiain平均灰度分别为:140.1 ±3.41；142.1±3.14；142.1±3.14;140.4 ±4.03;141.7±2.62;142.7±7.24,各组间无显著性差异(P=0.751).结论 用Triton X-100化学萃取方法是制备组织工程化神经移植体的有效方法.萃取人类长段粗大神经时,可适当延长萃取时间,不致破坏基底膜的主要成分层黏连蛋白.
关键词： 周围神经 组织工程 triton X-100 化学萃取 神经再生 -
聚氧乙烯辛烷基酚制备去细胞神经移植体的超微结构改变
目的 采用聚氧乙烯辛烷基酚(Triton X-100)去除异体周围神经中的雪旺细胞和髓鞘,制取天然神经细胞外基质的超微结构.方法 健康新西兰大耳白兔30只,分别自梨状肌下缘水平以远切取10 mm双侧坐骨神经60根,随机分为六组,其中12h组、24 h组、48 h组、96 h组、1 w组用于化学萃取,新鲜神经为对照组.神经萃取前先在手术显微镜下剪去表面的脂肪组织和部分神经外膜,然后置4℃蒸馏水中静置6h,以使细胞和髓鞘在低渗液体中膨胀、细胞被胀破,使之易于Triton X-100的渗透；再将神经放人3％的Triton X-100水溶液中分别静置12h,然后置于蒸馏水中震荡、漂洗6h,以使溶于水的Triton X-100膜蛋白复合体充分脱离神经干.如此反复,并且每次更换蒸馏水、Triton X-100水溶液.五组神经TritonX-100萃取时间分别为12h、24 h、48 h、96 h、1 w.在新鲜神经和萃取后的神经中段分别切取一段神经,2.5％戊二醛固定后,制成扫描电镜标本,用日立S-3500N型扫描电镜观察神经的立体结构并采集图像.结果 扫描电镜下观察,随着萃取时间的延长,神经内的轴突、髓鞘逐渐减少,少于96 h时仍可见有轴突、髓鞘的残留.萃取时间至96 h时神经内的轴突、髓鞘已被完全去除,可见由胶原纤维构成的立体管状结构,胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征,管内并可见膜样结构,为雪旺细胞基底膜.萃取时间为1 w的标本扫描电镜下观察,由胶原纤维构成的立体管状结构与96 h的标本相似,但结构较之稍散乱,形成的管腔不规则.结论 用Triton X-100化学萃取方法是制备组织工程化神经移植体的有效方法.萃取人类长段粗大神经时,为使雪旺细胞、轴突、髓鞘去除完全,可适当延长萃取时间.
关键词： 周围神经 组织工程 triton X-100 化学萃取 神经再生 -
化学去细胞同种异体神经修复家兔面神经缺损
目的 探索修复面神经缺损的一种新的有效替代材料.方法 24只兔子随机分成实验组(化学萃取同种异体腓神经移植组,12只)和对照组(自体新鲜面神经移植组,12只).每只兔子右侧面神经下颊支被切断以造成面神经缺损1 cm的模型,同时两组兔子分别以去细胞同种异体神经和自体面神经桥接修复.术后3个月行肌电图、电镜、图像分析仪以及靶肌肉运动终板染色检查.结果 术后3个月两组在神经传导速度、有髓神经纤维计数、靶肌肉运动终板计数上的差异没有统计学意义,电镜检查结果相似.结论 化学去细胞的同种异体神经在面神经缺损修复上是自体神经的一种有效替代物.
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猕猴组织工程化周围神经移植物的实验研究
目的评价利用化学萃取法获得的神经支架制备猕猴组织工程化周围神经移植物修复40mm尺神经缺损的效果.方法共使用成年猕猴9只,随机取其中的6只,培养自体雪旺细胞,应用已经制备好的去细胞神经为支架材料构建组织工程化周围神经移植体修复猕猴尺神经的40mm缺损.实验分实验组,空白组,正常对照组3组.术后5个月通过形态学,肌电检测和免疫组织化学方法观察.结果 3组均未发现猕猴双手有糜烂或溃疡形成,猕猴小鱼际肌群的饱满度和弹性于术前无明显差别.实验组与正常对照组间小鱼际肌群的运动动作电位潜伏期,大振幅及再生神经纤维的数目差异均无统计学意义(P>0.05).但在实验组与空白组间的差异有统计学意义(P<0.05).结论用自体源雪旺细胞微注入去细胞同种异体神经支架构建的组织工程化神经移植物修复猕猴40mm的尺神经缺损,可取得与自体神经移植相似的效果.
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无细胞的异体神经修复鼠坐骨神经缺损
目的通过化学萃取同种异体神经,去除髓鞘和雪旺细胞,形成无细胞基膜管后桥接鼠坐骨神经缺损,研究神经再生效果.方法正常鼠坐骨神经用非变性生物剂处理后得到无细胞的基膜管,桥接鼠坐骨神经20mm缺损.实验分3组:无细胞基膜管移植组(A组),自体神经移植组(B组)和异体神经移植组(C组).术后进行肌电图、光镜、电镜及图象分析仪检查.结果 A组再生神经有大量轴突通过移植体,术后2个月电生理检测再生神经的潜伏期及波幅低于B组(P＜0.05),术后3个月2组差异无显著意义.髓鞘厚度在术后3个月时亦低于B组,差异有显著意义(P＜0.05).轴突直径及数目两组无差异.C组因无神经再生,结果无法测量.结论这种无细胞基膜管移植体能支持轴突的生长和雪旺细胞的迁移,是一种良好的神经移植替代材料.
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去细胞同种异体移植面神经材料的制备
目的构建异体组织工程化面神经,提供具有仿生结构的支架.方法取8段长5 cm、直径2mm兔的面神经,其中2段不行处理作为正常对照,其余6段分成3组,用3%三硝基甲苯和4%脱氧胆酸钠分别萃取1、2和3次,在萃取神经和未萃取神经的中段取材,行苏木精-伊红染色、Masson染色和S-100免疫组化染色,在光镜和电镜下观察神经萃取前后形态学的变化.结果用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取后,面神经内的细胞消失,而纤维性支架结构与未经萃取的神经相仿,电镜下可见萃取后的神经由空的神经基膜管和管之间的胶原纤维构成.随着萃取次数的增加,神经内残留的S-100蛋白减少,但反复萃取后神经的支架结构受破坏.结论用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取2次可去除兔面神经的细胞而保留完整的神经基膜管和纤维支架结构,是制备具有仿生结构的组织工程化面神经支架较为理想的方法.
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化学萃取去细胞异体神经修复颞骨内面神经缺损
目的 为修复颞骨内面神经缺损提供一种理想的替代材料.方法 20只兔随机分成实验组和对照组,制成颞骨内面神经缺损8 mm模型,分别以化学萃取去细胞异体神经和自体神经移植修复,每组10只.术后3个月通过辣根过氧化物酶逆行示踪和再生神经纤维的组织学检测观察效果.结果 两组均在术侧面神经核内发现被标记的神经元细胞,移植段内有大量的新生有髓神经纤维和新生血管等,移植段和移植远段内再生神经纤维具有正常的形态和结构.结论 化学萃取去细胞异体神经很有可能成为自体神经的替代材料用于颞骨内面神经较长段缺损的修复.
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大鼠坐骨神经去细胞基膜管异体移植的比较研究
目的:探讨化学萃取法(CEN)、冻融法(FTN)制备的异种鼠坐骨神经去细胞基膜管移植术后8、13、23天神经再生轴突距离、Schwann细胞迁入、再血管化及炎症反应异同.方法:将36只雌性Wistar鼠随机配对,分为CEN组与FTN组,每组18只,分别桥接移植两种方法制备的Sprague-Dawley鼠坐骨神经去细胞基膜管.观察术后8、13、23天移植物物理性状及组织形态学变化.结果:术后8、13、23天,神经轴突再生距离、近和远端Schwann细胞数、再血管化及炎症反应差异有显著性(P<0.05),CEN组优于FTN组.结论:化学萃取法制备的异种周围神经去细胞基膜管较冻融法能更快、更好地修复周围神经缺损,亦应有更大的临床实用价值.
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改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究
[目的]改进去细胞异体神经化学萃取制备方法,制备出细胞及髓鞘去除完全、神经机构保存完好的去细胞异体神经移植物.[方法]SD大鼠14只,取双侧坐骨神经(共28根),分3组进行化学萃取去细胞处理:Sondell法组(10根)、改良法组(10根)和对照组(8根).Sondell法组所用萃取剂为Triton X-100和脱氧胆酸钠;改良法组所用萃取剂为Triton X-200、SB-10和SB-16;对照组未进行化学处理.处理后神经行HE染色、快蓝染色、基底膜素免疫组化染色及环境扫描电镜观察,并从去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面综合评价.[结果]在去细胞异体神经物理性状方面,改良法制备的去细胞异体神经韧性弹性略好于Sondell法;HE染色表明,2种方法的去细胞效果均较好,但改良法对神经结构的破坏较小;快蓝染色、基底膜素免疫组化染色、环境扫描电镜结果均表明,改良法在对髓鞘的去除、基底膜素的保留及神经结构的保存方面均优于Sondell法;综合质量评分结果表明,2种方法在去细胞效果方面相似(P1＞0.05),髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法(P2、P3＜0.05),综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性3方面,改良法制备的去细胞异体神经质量优于Sondell法(P4＜0.05).[结论]综合运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法,是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法,能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物,为自体神经移植找到了较好的替代解决方法.
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三种脱细胞神经修复大鼠坐骨神经缺损效果的比较
目的 比较三种去细胞神经支架修复大鼠坐骨神经缺损效果差异.方法 取大鼠坐骨神经39条,分别用甘油(A组)、叠氮钠(B组)、三硝基甲苯(C组)萃取,每组13条.观察萃取神经结构.用A、B、C三组神经支架修复1.5 cm长的SD大鼠坐骨神经缺损,另设自体神经移植组(D组)和空白对照组(E组),每组10只,术后12周比较五者的修复效果.结果 萃取后A组90%细胞、B、C100%细胞消失,纤维性支架结构A组95%完整;而B、C组仅30%.修复后小腿三头肌湿重、神经电生理A、B、C三组修复大鼠坐骨神经缺损效果相当(P＞0.05),与D、E组比较(P＜0.05)、差异有统计学意义.结论 甘油、叠氮钠、三硝基甲苯等萃取神经可较好地修复坐骨神经缺损,但甘油处理神经为简单.
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去细胞同种异体移植面神经材料的制备
目的:探讨如何构建异体组织工程化面神经,提供具有仿生结构的支架.方法:取8段长5 cm、直径2 mm兔的面神经,其中6段用3%三硝基甲苯和4%脱氧胆酸钠分别萃取1、2和3次,在萃取神经和未萃取神经的中段取材,行HE染色、Masson染色和S-100免疫组化染色,在光镜和电镜下观察神经萃取前后形态学的变化.结果:用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取后,面神经内的细胞消失,而纤维性支架结构与未经萃取的神经相仿,电镜下可见萃取后的神经由空的神经基底膜管和管之间的胶原纤维构成.随着萃取次数的增加,神经内残留的S-100蛋白显著减少,但反复萃取后神经的支架结构受破坏.结论:用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取2次可去除兔面神经的细胞而保留完整的神经基底膜管和纤维支架结构,是制备具有仿生结构的组织工程化面神经支架较为理想的方法.
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化学萃取同种异体神经修复鼠坐骨神经缺损
目的:通过化学萃取同种异体神经,去除髓鞘和雪旺细胞,形成无细胞基膜管后桥接鼠坐骨神经缺损,研究神经再生效果.方法:正常鼠坐骨神经用非变性生物剂处理后得到无细胞的基膜管,桥接鼠坐骨神经20 mm 缺损.实验分3组:无细胞基膜管移植组(A组)、自体神经移植组(B组)和异体神经移植组(C组).术后进行肌电图、组织形态学及图像分析仪检查.结果:A组再生神经有大量轴突通过移植体,术后2个月电生理检测再生神经的潜伏期及波幅低于B组(P＜0.05),3个月时差异无显著性.髓鞘厚度在术后3个月时亦低于B组,差异有显著性(P＜0.05).轴突直径及数目两组无差异.结论:这种无细胞基膜管移植体能支持轴突的生长和雪旺细胞的迁移,是一种良好的神经移植替代材料.
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雪旺细胞移植与周围神经再生
广泛阅读近年来有关人工神经方面的文献,重点了解桥接神经的移植体和雪旺细胞移植方面的研究进展.自体材料,异体材料和合成材料均可作为桥接神经缺损的神经导管,以化学萃取的同种异体神经较为理想,雪旺细胞体外纯化和培养后仍具有生物活性,用微注入法把雪旺细胞植入移植物内可促进神经轴突的再生.理想的人工神经应由有特定的三维结构的生物材料和有生物活性的雪旺细胞构成,雪旺细胞在支架内有序的分布,类似于 Bü ngner带.
