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H-89和wortmannin对forskolin和IBMX促进受损视网膜节细胞再生作用的影响
目的探讨forskolin 和IBMX促进受损视网膜节细胞(RGCs)再生的作用机制. 方法采用荧光逆行示踪标记术和自体坐骨神经移植术,研究蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89或/和PI3-K特异抑制剂wortmannm玻璃体内注射对forskolin和IBMX促进成年金黄地鼠受损RGCs再生的影响.结果H-89和wortmannin均可部分抑制forskolin和IBMX对受损RGCs的促再生作用,wortmannin的抑制作用更大;两药联合应用,可完全抑制forskolin和IB-MX对受损RGCs的促再生作用. 结论forskolin和IBMX可能是通过PKA-CREB和PI3-K-Akt通路实现对受损RGCs的促再生作用.
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蛋白激酶A抑制剂H-89的致心律失常效应及机制
目的 观察蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89对大鼠心律和心肌细胞膜内向整流钾电流(IK1)、钠钙交换体电流(INa/Ca)的影响,从而评估其药理学应用价值.方法 成年SD大鼠麻醉后开胸取出心脏行Langendorff主动脉逆行灌流,记录心电图,观察H-89给药20 min内对离体心脏节律的影响.应用全细胞膜片钳技术观察H-89对胶原酶分解的大鼠心室肌细胞膜IK1和INa/Ca的影响.结果 1～10 μmol/L H-89可在大鼠离体心脏诱发明显的心律失常,室性期前收缩(PVB)数目,室速(VT)、室颤(VF)持续时间和发生率呈浓度依赖性增高(P＜0.05).膜片钳记录结果显示,H-89可浓度依赖性抑制IK1(P＜0.05),在5 μmol/L时即可完全阻断IK1,类似于0.5 mmol/L氯化钡(BaCl2)的效应.但H-89(1～10 μmol/L)对INa/Ca无明显作用(P＞0.05).结论 H-89对心肌细胞膜电流的异常扰动是其致心律失常风险的主要电生理学机制,可由PKA依赖性或非PKA依赖性药理学作用共同介导.
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Urocortin致大鼠心肌细胞肥大由PKA信号通路介导
目的 通过观察PKA拮抗剂H-89和CRF受体拮抗剂Astressin抑制UCN诱导乳大鼠心肌细胞肥厚的作用,研究UCN诱导的大鼠心肌细胞肥厚的信号转导机制.方法 以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型,应用UCN 0.1μmol·L-1诱导心肌肥大,观察H-89 0.1 μmol·L-1和Astressin 1 μmol·L-1的作用,探讨UCN 0.1μmol·L-1对心肌肥厚的作用机制.用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;[3H]亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白的合成;用Western蛋白印迹法测定ANP表达.结果 UCN 0.1 μmol·L-1使心肌细胞体积、蛋白合成和ANP表达明显增加,H-89 0.1μmol·L-1和Astressin 1μmol·L-1抑制UCN诱导的心肌肥大.结论 Urocortin可能通过CRF-R2并通过PKA信号通路诱导乳大鼠心肌细胞肥大.
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蛋白激酶A抑制剂H-89通过Wee1B蛋白调控小鼠1-细胞期受精卵发育
目的:探讨蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89通过调控小鼠蛋白激酶Wee1B蛋白S15位点磷酸化状态影响小鼠1-细胞期受精卵的发育.方法:超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵,经H-89预处理后显微注射Wee1B-mRNAs,相差显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定M期促进因子(MPF)活性;免疫印迹检测Wee1B蛋白表达、CDC2-pTyr15和Wee1B-pSer15磷酸化及Wee1B-pSer15非磷酸化状态.结果:H-89持续存在时,在受精卵G1和S期检测到Wee1B-Ser15的磷酸化条带,在G2期和M期检测到Wee1B-Ser15的非磷酸化条带;小鼠受精卵有丝分裂进程加快,但过表达Wee1B-WT和过表达突变体Wee1B-S15A/D均能延缓受精卵有丝分裂进程,逆转由H-89引起的促进分裂作用.结论:H-89抑制PKA活性,从而抑制Wee1B蛋白S15位点的磷酸化状态,但过表达Wee1B-S15A/D有效逆转H-89加速的G2/M期转换,使受精卵的分裂延迟.提示Wee1B蛋白的S15位点可能是PKA作用的生理靶点.
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蛋白激酶A对CDC25B蛋白S149与S321位点磷酸化的修饰抑制小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂
在小鼠1-细胞期受精卵,蛋白激酶A (protein kinase A,PKA)可通过磷酸化细胞分裂周期25B (cell division cycle 25B,CDC25B)的321位Ser引起受精卵分裂阻滞.本文旨在研究PKA对CDC25B 149位点Ser的磷酸化对小鼠受精卵发育的影响,及其与321位点的关系.质粒pBSK-CDC25B-WT (野生型)、pBSK-CDC25B-S149A (149位Ser突变成Ala)、pBSK-CDC25B-S321A (321位Ser突变成Ala)、pBSK-CDC25B-S 149A/S321A (149位和321位Ser联合突变成Ala)体外转录成mRNAs;显微注射入小鼠S期受精卵中,在PKA抑制剂H-89预处理的M16培养基中培养,观察其对受精卵发育、有丝分裂成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)活性及CDC2-Tyrl5磷酸化状态的影响.结果显示,H-89呈剂量(0～50 μmol/L)依赖性的方式加速小鼠受精卵卵裂.然后选择卵裂率接近100％、H-89 (40 μmol/L)培养的小鼠受精卵,与对照组相比,CDC25B各种mRNAs注射组受精卵卵裂率明显增高,MPF活性提前达到高峰；CDC2-Tyrl5磷酸化状态和MPF活性变化相一致,以上结果说明,CDC25B蛋白的149位Ser也是PKA在体内调控CDC25B的重要靶点.因此在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠CDC25B蛋白S149位点与S321位点的磷酸化修饰可能是控制受精卵G2/M转换的重要方式.
关键词： 细胞分裂周期25B 蛋白激酶A 有丝分裂成熟促进因子 H-89 小鼠受精卵 -
H-89对坐骨神经结扎大鼠触诱发痛和脊髓背角磷酸化CREB表达的影响
Objective To investigate the effects of a highly selective cAMP-dependant protein kinase(PKA)inhibitor, H-89, on tactile allodynia, as well as cyclic AMP response element binding protein (CREB) phosphorylation in the ipsilateral spinal dorsal horn neurons induced by chronic constriction injury(CCI) of the sciatic nerve in rats. Methods In part one, after CCI model had been successfully established, twenty eight female SD rats weighing (250+ 20)g were randomly allocated to one of four groups( n= 7): control group received solvent; H1, H2 and H4 group received H-89 1,2,and 4 nmol respectively. Drugs were delivered via L5-6 acute puncture after briefly anesthetized with isoflurane. Mechanical withdrawal threshold (MWT) were determined at before and 15, 30, 60 min after drug-delivery. In part two, five groups ( n= 6), including a sham group( sham surgery received solvent), and four CCI groups received drugs( H1, H2, H4group) or solvent(DMSO group) as described above were euthanatized 30 min after drug delivery to investigate the effect of H-89 on CREB phosphorylation in the superficial neurons of the ipsilateral spinal dorsal horn. CREB phosphorylated (pCREB) neurons were detected by immunohistochemistry. Results MWT increased after drug administration, but there were no statistical significance in the 1 nmol group, compared to baseline or control group( P 》0.05). 15 min after drug delivery, MWT significantly increased( P 《 0.01, compared to baseline or control group) in the 4 nmol group. The number of pCREB positive neurons in the L4-5 spinal dorsal horn and their gray level were reduced by H-89 administration( P 《0.01, compared to DMSO group). Conclusion PKA inhibitor H-89 can attenuate tactile allodynia induced by chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats, and inhibit CREB phosphorylation in the spinal dorsal horn neurons following CCI, indicating PKA/CREB signaling pathway plays an important role in the maintance of neuropathic pain.
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受磷蛋白磷酸化位点Ser16在心肌缺氧预适应中的作用
目的 探讨由蛋白激酶A(PKA)介导的受磷蛋白磷酸化位点16-丝氨酸(PLB-Ser16)在缺氧预适应中对心肌细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的调控作用.方法 体外培养的乳鼠心肌细胞随机分成四组:正常培养(C)组,缺氧-复氧损伤(H-R)组、缺氧预适应(HP)组和H-89干预(H-89)组.检测各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)、[Ca2+]i和细胞凋亡率.用免疫印迹法和放射自显影法测定PLB的蛋白表达和磷酸化水平.结果 H-R组的LDH值、[Ca2+]i及细胞凋亡指数均显著高于C组和HP组(P＜0.05)；H-R组PLB的蛋白表达和磷酸化水平较C组均降低(P＜0.05),HP组较C组增加(P＜0.05)；H-89组的LDH值、胞内钙荧光强度值及细胞凋亡指数均较HP组明显升高(P＜0.05),而PLB的蛋白表达和磷酸化水平显著下调(P＜0.05).结论 缺氧预适应对心肌细胞缺氧-复氧损伤的保护作用可能与PLB磷酸化水平上调有关；PKA抑制剂H-89可降低这种心肌保护作用.
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H-89对大鼠心肌细胞膜电流的影响
目的 评估蛋白激酶A(PKA)抑制剂H-89对大鼠心室肌细胞膜主要离子通道和转运体的影响.方法 应用全细胞膜片钳技术观察H-89对胶原酶分解的成年SD大鼠心室肌细胞膜离子电流L-型钙电流(I_(Ca-L))、电压门控钠电流(I_(Na))、内向整流钾电流(I_(K1))、瞬时外向钾电流(I_(to))和钠钙交换体电流(I_(Na/Ca))的影响.结果 1～10 μmol·L~(-1) H-89可浓度依赖性抑制I_(Ca-L)、I_(Na)、I_(to)(P<0.05);对I_(K1)有更强的抑制作用,在较低浓度(5μmol·L~(-1))时即可完全抑制I_(K1)(P<0.05),与0.5 mmol·L~(-1)氯化钡的作用类似.但在1～10 μmol·L~(-1)浓度范围内H-89对I_(Na/Ca)无明显作用(P>0.05).结论 H-89对心肌细胞膜电流的影响可能是其对通道的直接作用或间接通过抑制PKA所致.
