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间充质干细胞的成骨细胞分化和免疫组织化学鉴定
目的 探讨脐带的间充质干细胞分化为成骨细胞的影响因素和免疫组织化学鉴定.方法 收集306例冻存的健康胎儿脐带,采用华尔通胶组织块贴壁法从脐带组织中分离间充质干细胞,利用荧光显微镜观察原代细胞的细胞形态.脐带间充质干细胞的免疫表型和细胞周期采用免疫组织化学检测.复苏冻存的脐带间充质干细胞,并传代培养至10代.对第10代的脐带间充质干细胞进行成骨诱导,其成骨能力分别通过钙结节和骨涎蛋白的免疫荧光检测以及茜素红染色检测来确定.结果 免疫组织化学结果显示,培养的细胞高表达间充质干细胞的表面标志物CD73、CD90和CD105,但是不表达造血细胞的表面标志物CD34和CD45.复苏后细胞的存活率是90％.细胞周期显示,第10代的细胞有80％处于G0/G1期,20％处于S+G2/M期.成骨细胞刺激因子诱导干细胞的骨涎蛋白染色呈阳性,并形成矿化的钙结节.结论 冻存的脐带间充质干细胞在成骨细胞刺激因子下能被诱导分化为成骨细胞,具有高度自我增殖和多向分化能力.
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成骨细胞骨涎蛋白成熟肽修饰位点和进化踪迹分析
目的 探讨成骨细胞中骨涎蛋白(BSP)的表达以及进化踪迹,并对成熟肽基因行序列分析,获得BSP修饰位点.方法 体外培养成骨细胞,提取成骨细胞总RNA,反转录合成eDNA,以特异性引物扩增BSP成熟肽基因并克隆到pBluescript KS载体,筛选阳性克隆进行序列测定.以成骨细胞的骨涎蛋白为种子序列,利用多种生物信息学工具进行细胞的骨涎蛋白的序列查找及其同源蛋白的搜索,并以此为基础对骨涎蛋白的进化踪迹位点及相关的功能位点进行比较研究.结果 共得到具有完整结构域的同源蛋白序列72条,骨涎蛋白家族的BSP-前肽结构域具16个全家族保守残基,以及10个RGD结合域和BSP结构域的33个亚家族特异性残基.骨涎蛋RGD结构域的配基结合位点主要分布于结合口袋的中间区域.PCR扩增到一特异性的900bp片段,克隆后筛选出阳性克隆进行序列分析,测定结果与数据库的序列基本相同.结论 成骨细胞中能表达并翻译为有活性的BSP,BSP成熟肽存在甲基和乙酰化修饰位点.
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体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中的应用
体外细胞三维培养技术能模拟体内细胞之间以及细胞胞外基质间信号转导的微环境,既能保留体内细胞微环境的物质结构基础,又可体现细胞培养的直观性及条件可控性.近年来,体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中有着广泛应用,是外源化合物遗传毒性、肿瘤多细胞耐药、抗肿瘤药物高通量筛选、皮肤毒理学研究以及药物代谢与毒性试验等研究的有力工具.本文就体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中的应用作简要综述.
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应用旋转生物反应器培养小鼠胚胎干细胞的初步研究
目的 应用旋转生物反应器(RCCS)和微载体培养体系尝试建立一种实现批量培养干细胞的新方法.方法 应用RCCS和微载体培养体系对小鼠胚胎干细胞(mESCs)进行体外培养扩增,定期收集细胞样品,镜下观察mESCs在RCCS生长的形态特征,并定量绘制细胞生长曲线,利用MATLAB软件计算细胞生长参数并对照平面培养体系,利用H&E染色、免疫荧光及RT-PCR技术对RCCS内培养的mESCs的细胞形态,未分化标志蛋白(SSEA-1)和标志基因(oct-4)的表达进行定性或半定量分析.结果 mESCs可在RCCS内以贴附于微载体表面的形式实现三维生长,其生长增殖状态良好,且伴随培养时间的延长,SSEA-1蛋白及oct-4 基因的表达水平逐渐降低.这表明RCCS内培养扩增的mESCs逐渐走向分化,该分化进程同步于平面对照培养体系.结论 RCCS可以为mESCs的体外规模化扩增培养提供良好的培养体系.
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天花粉蛋白对黑色素瘤细胞血管生成拟态及PI3K信号通路的影响
血管生成拟态 (vasculogenic mimicry,VM)是对经典的内皮性血管生成之外肿瘤血管生成方式的重要补充,临床上针对VM抑制将可能成为肿瘤治疗的新靶点[1-2].天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是从中药栝楼中提取的一种碱性蛋白质,近年来发现对胎盘滋养层的肿瘤及其它多种肿瘤均具有抗肿瘤作用[3-4].本研究观察天花粉蛋白对体外三维培养的恶性黑色素瘤细胞血管生成拟态及磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K)信号通路的影响,探讨天花粉蛋白的抗肿瘤作用及机制.
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用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片构建及培养条件研究
目的：设计制作用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片,以海藻酸钙凝胶为细胞支架,基于芯片研究适合的凝胶形成、溶解条件,利用该条件长期培养SMMC-7721细胞并检测其活力。方法利用CDR软件、软光刻技术、模塑法、等离子键合法等设计并制作出微流控芯片并验证其适用性；在芯片中三维培养肝肿瘤细胞SMMC-7721,观察细胞形态,以IPP软件辅助计算细胞在72h的存活率。结果设计制作的微流控芯片适合于肿瘤细胞三维培养；芯片中培养的肝癌细胞72 h内生长状态良好,存活率达(96．1±4．5)%,细胞堆积排列紧密,出现肿瘤细胞聚集体( tumor cell spheroid, TCS)。结论该文设计构建用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片,并用于肝癌细胞SMMC-7721培养,细胞生长状态良好,且细胞生长与聚集状态表现出一定特殊性。利用该芯片进行肿瘤细胞三维培养,可以为肿瘤细胞生长状态研究及抗肿瘤药物筛选提供更有利的方式。
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地塞米松对三维培养大鼠肝细胞分泌的影响
三维培养是近年发展起的技术,能够模仿体内的结构特点[1].肝细胞三维培养主要应用于人工生物肝研究及肝细胞疾病基础研究中,我们利用该技术研究地塞米松(dex)对肝细胞形态的影响并探讨其机制.
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体外肝细胞三维培养的研究进展
肝细胞体外培养如何能长时间维持肝细胞分化表型及功能活力，是目前生物人工肝研究关键问题之一。体外培养细胞功能改善的一个重要原则就是模拟体内细胞环境，由此，众多研究学者提出体外肝细胞三维培养是解决上述问题的有效途径。近年来，国内外在该领域取得了较大的进展，使体外肝细胞培养功能活力、细胞分化表型维持时间都大大延长。本文就近年来体外肝细胞三维培养的研究进展、存在问题及展望做一简要综述。
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自组装短肽GFS-4作为细胞三维培养及心肌梗死修复支架材料的研究
本研究探索自组装短肽GFS-4在心肌细胞三维培养中的应用效果及其对心肌梗死区域的组织修复作用.通过圆二色谱仪分析短肽GFS-4的二级结构,原子力显微镜检测短肽GFS-4自组装的微观形态.将GFS-4自组装形成的纳米纤维支架作为心肌细胞三维培养材料,观察心肌细胞的生长状况;建立大鼠心肌梗死模型,加入水凝胶GFS-4研究其对心肌梗死修复的效果.结果发现,GFS-4自组装形成的二级结构主要为β折叠;自组装24h后形成致密的纳米纤维支架;心肌细胞三维培养结果表明心肌细胞在GFS-4水凝胶中生长状况良好;心肌梗死体外修复实验发现,短肽GFS-4水凝胶支架可缓解心肌梗死区域组织坏死.自组装短肽GFS-4作为新的纳米支架材料,可用于细胞三维培养和心肌梗死区域组织修复.
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一种新型的鼠尾胶滴胃癌细胞三维培养模型的建立与药敏初探
目的：建立一种简便的鼠尾胶原包被的胃癌细胞体外三维培养和药敏技术，初步评估该方法的稳定性和可行性。方法：以国产鼠尾胶原溶液为原料，制备包裹有胃癌细胞株的胶滴，在培养基中培养8天，观察BGC823细胞株在胶滴中的生长情况。接着对胶滴中的细胞克隆进行染色，捕捉胶滴中的数字图像，利用软件计算图像内染色区域的积分光密度值（ integrated optical density，IOD），对胶滴中的细胞活力进行定量；后初步计算两种不同浓度的顺铂组BGC823细胞株的存活率。结果：成功建立一种新型的胃癌细胞鼠尾胶滴三维培养模型。结论：初步证实了基于此模型进行后续药敏实验的可行性。
