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Notch1、Notch3及Hes1在胃肠道间质瘤中的表达及临床意义
目的 探讨胃肠道间质瘤(GIST)患者肿瘤组织中Notch信号通路相关蛋白Notch1、Notch3及Hes1表达水平及临床意义.方法 采用实时定量PCR (Q-PCR)和Western blot方法检测135例新鲜GIST标本及临近非肿瘤组织中Notch1、Notch3及Hes1 mRNA和蛋白表达情况.同时采用免疫组织化学方法检测Notch1、Notch3及Hes1蛋白表达情况,并分析各蛋白表达与GIST患者临床病理因素的关系.另将野生型小鼠(WT)和Notch1基因敲除小鼠(KO) 40只,分为WT组、KO组、WT+ GIST组和KO+GIST组,检测各组Notch1、Notch3及Hes1蛋白表达情况.结果 与临近非肿瘤组织相比,GIST组织中Notch1、Notch3及Hes1 mRNA和蛋白表达均上调(P＜0.05).GIST标本的Notch1、Notch3、Hes1阳性率(5926％、65.19％、62.22％)均高于临近非肿瘤组织(17.78％、22.22％、17.78％),差异有统计学意义(P＜0.05).统计分析证实Notch1蛋白表达与GIST的NIH分级密切相关(x2=8.532,P=0.002);Notch3蛋白表达与GIST的肿瘤转移密切相关(x2=7.532,P=0.003);Hes1蛋白表达与GIST的肿瘤大小密切相关(x2=6.781,P=0.012).各组小鼠Notch1、Notch3及Hes1蛋白表达情况显示,与WT组相比,WT+ GIST组小鼠体内3种蛋白表达升高(P＜0.05);与KO组相比,KO+GIST组小鼠体内3种蛋白表达无明显变化(P＞0.05);与WT+ GIST组相比,KO+ GIST组小鼠体内3种蛋白表达降低(P＜0.05).结论 Notch信号通路相关蛋白Notch1、Notch3及Hes1在GIST患者组织中表达升高,Notch信号通路的激活可能在GIST发生、发展过程中起重要作用.
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沉默Notch3的慢病毒载体构建包装及在鼻咽癌细胞的沉默效果
目的：在慢病毒载体pSIH‐H1构建干扰人Notch3基因的载体，在293T细胞包装并在鼻咽癌细胞中检测Notch3的表达。方法沉默Notch3的寡核苷酸序列连接慢病毒载体pSIH‐H1，测序。在293T 细胞包装病毒，测定其滴度。在鼻咽癌细胞中CNE2感染慢病毒，Western Blot分析沉默效果。结果慢病毒载体pSIH‐H1‐Notch3测序正确，在293T细胞中可以观察到GFP的表达，Western Blot证实可以在鼻咽癌细胞中沉默Notch3的表达。结论在慢病毒干扰载体pSIH‐H1构建沉默Notch3载体正确，包装病毒可在鼻咽癌细胞中沉默Notch3，可以用于鼻咽癌干细胞的研究。
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脑白质疏松与Notch3基因突变相关性研究
目的:探讨脑白质疏松(LA)与Notch3基因突变的关系.方法:应用限制性内切酶序列和错配引物试验,对96例影像学表现为LA患者的Notch3基因第4外显子133bp基因位点(Arg133→Cys)突变热点碱基进行检测和分析,并与42例正常人进行对照.结果:LA患者和对照组Notch3基因第4 外显子Arg133→Cys未发生突变.结论:目前未发现LA与Notch3第4 外显子Arg133→Cys突变的相关性.但Notch3基因突变有多个不同位点和多态性,可增加其他突变位点的检测,可望提高Notch3基因突变检测率,进一步了解Notch3基因功能及其在脑白质损害疾病中的发生和发展意义.
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Notch3表达下调在诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用
目的:探讨Notch3在心肌成纤维细胞(CFs)向肌成纤维细胞(MFs)转化中的作用.方法:用胶原酶消化法分离培养SD仔鼠的CFs,将其于不同浓度的转化生长因子-β1(TGF-β1)孵育24h.用Western blot检测CFs中平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)及Notch3的表达量,用ELISA法检测细胞上清羟脯氨酸含量,用Real-Time PCR检测Notch3 mRNA表达量;利用RNAi法干扰CFs中Notch3的表达,用实时PCR及Westem blot检测干扰效果;Western blot检测α-SMA蛋白表达量,ELISA检测各组细胞上清羟脯氨酸含量.结果:TGF-β1可浓度依赖性地诱导CFs细胞上清羟脯氨酸含量增加和α-SMA表达增加,同时使Notch3表达下降,其中2 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml 3个浓度组与对照组相比有统计学差异(P＜0.05).RNAi法干扰Notch3后,干扰组与对照组相比,Notch3 mRNA及蛋白表达均下降(P＜0.05),同时,干扰组细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达均增加(P＜0.05).结论:Notch3表达下调能诱导CFs向MFs转化.
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Notch3和HES1蛋白在非小细胞肺癌中的表达及预后
目的:检测Notch3和HES1蛋白在非小细胞肺癌原发肿瘤组织中的表达,并分析其与预后的关系.方法:采用免疫组织化学法检测Notch3和HES1在2008年1月至2012年12月四川大学华西医院收集的199例肿瘤组织中的表达.数据分析采用SPSS 12.0.结果:Notch3和HES1在肺癌组织中的阳性表达率分别为39.7%,45.7%.Notch3阳性组总体生存率低于阴性组(P=0.0038),两组无进展生存率差异不具有统计学意义(P=0.07).HES1阳性组总体生存(P<0.001)及无进展生存率(P=0.001)均低于阴性组.Notch3-HES1共表达组总体生存(P<0.001)及无进展生存率(P=0.003)均低于非共表达组.多因素分析显示,HES1阳性组的总体生存率及无进展生存率更低(均P<0.001).结论:非小细胞肺癌中存在Notch3-HES1通路的过度活化,并且是不良预后的预测因子.
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TGF-β上调Notch3诱导上皮间质转化在促进肺癌骨转移中的作用
目的:研究TGF-β上调Notch3表达诱导EMT在肺癌骨转移中的作用.方法:免疫荧光、蛋白印记和RT-PCR方法检测Notch3在TGF-β诱导下上皮、间质标记物以及上皮间质转化相关转录因子Twist、Snail和ZEB-1的表达变化;利用慢病毒包装Notch3正义表达载体和ZEB-1 siRNA载体分别上调Notch3和抑制ZEB-1的表达后,采用免疫荧光、蛋白印记方法检测抑制EMT转录因子ZEB-1的表达后,对上皮间质标记物的影响;进而通过体外迁移和侵袭试验观察抑制ZEB-1的表达后对Notch3高表达细胞系的迁移和侵袭能力的影响;后体外ELISA法检测骨转移相关分子pTHrP和IL-6的表达,探讨Notch3通过诱导EMT在促进肺癌骨转移中的作用.结果:Notch3 siRNA抑制其表达后能够逆转TGF-β诱导的上皮标记物和间质标记物的表达变化,这一现象是通过影响EMT转录因子ZEB-1实现的.进而利用慢病毒包装系统,构建了Notch3过表达细胞株和ZEB-1 siRNA细胞株,免疫荧光和蛋白印记试验发现,Notch3过表达载体能够抑制上皮标记物的表达,上调间质标记物的表达,促进EMT的发生,而抑制ZEB-1的表达后能够逆转这一现象.后,体外侵袭试验和ELISA试验发现,Notch3高表达能够增加肺癌细胞的侵袭能力以及pTHrP和IL-6的分泌,而抑制ZEB-1的表达后可明显降低其转移能力以及pTHrP和IL-6的分泌.结论:Notch3参与了TGF-β诱导肺癌细胞上皮间质转化过程,并在NSCLC骨转移中发挥作用.
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siRNA下调Notch3表达对非小细胞肺癌骨转移能力的影响
目的:研究Notch3在肺癌骨转移中的作用.方法:通过RT-PCR方法检测Notch3在NSCLC及其伴骨转移患者的肺癌组织中的表达情况;利用慢病毒包装Notch3 siRNA载体抑制Notch3的表达后,通过体外迁移和侵袭试验观察Notch3 siRNA对肺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响;通过体外ELISA法检测骨转移相关分子pTHrP和IL-6的表达,研究阻断Notch3的表达后是否能够逆转TGF-β诱导的肺癌骨转移.结果:Notch3在NSCLC发生骨转移的患者肺癌组织中过表达.体外试验发现,通过慢病毒包装Notch3 siRNA载体抑制Notch3的表达后,NSCLC细胞的转移能力下降,且Notch3-si可明显抑制NSCLC细胞中由TGF-β介导的pTHrP和IL-6的表达.结论:Notch3高表达在促进NSCLC骨转移中发挥重要作用.
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Notch信号在神经肽P物质对高氧暴露肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用机制
目的 探讨Notch信号在神经肽P物质(substance P,SP)对高氧状态下早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的作用机制.方法 将原代分离培养的大鼠孕19d胎鼠AECⅡ随机分为4组:空气组和高氧组分别暴露在210mL/L和950mL/L氧气中;高氧+SP组于暴露前加SP;高氧+SP+L703.606组在高氧+SP组基础上加入SP受体拮抗剂L703.606.各组均培养24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;微孔板检测系统和激光共聚焦显微镜检测超氧化物阴离子水平;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖能力;QPCR检测Notch1、Notch3基因的表达;Western blot检测Notch1、Notch3蛋白的表达.结果 与空气组比较,高氧组细胞凋亡率及超氧化物阴离子的含量均显著增高,增殖率显著下降(P<0.01);高氧+SP组可显著降低细胞凋亡率及超氧化物阴离子的表达,提高细胞增殖率(P<0.01).高氧组Notch1基因和蛋白的表达均明显降低(P<0.01),Notch3基因和蛋白水平表达均明显升高(P<0.01),高氧+SP组与单纯高氧组比较,Notch1基因和蛋白水平表达升高,Notch3基因和蛋白水平表达降低,差异具有统计学意义(P<0.01).高氧+SP+L703.606组与高氧组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 SP可通过调控Notch信号通路的表达,抑制高氧诱发的AECⅡ细胞凋亡,减轻氧化损伤,促进细胞增殖的作用.
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Notch3在乳腺组织中的表达以及与乳腺癌癌变进展的关系
目的检测乳腺组织中Notch3的蛋白表达水平,以及分析其与乳腺癌患者临床病理参数的关系.方法应用免疫组织化学染色方法检测了Notch3在癌旁正常乳腺组织和乳腺浸润性导管癌中的表达水平,并且运用统计方法进一步分析了Notch3表达水平和乳腺癌患者临床病理参数的关系.结果 Notch3的蛋白水平在乳腺癌组织中显著高于癌旁正常乳腺组织,=0.000；Notch3的蛋白高表达和乳腺癌患者淋巴结转移呈正相关,=0.000,在TNM各分期中差异明显,和更高的分期呈正相关,=0.004；在病理学分级中差异明显,和更高的分级呈正相关,=0.035.结论 Notch3的高表达可能存进乳腺癌的癌变和进展.
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Notch3过表达对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的抑制作用
目的:探讨Notch3过表达对心肌成纤维细胞(CFs)向肌成纤维细胞(MFs)转化的作用.方法:用胶原酶消化法分离培养SD仔鼠的CFs,将CFs于10 ng/ml转化生长因子-β1(TGF-β1)中孵育24 h,用羟脯氨酸试剂盒检测细胞上清羟脯氨酸含量,免疫荧光法检测CFs中平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,用Western-blotting检测Notch3蛋白表达;利用慢病毒转染CFs,使其过表达Notch3,确定佳转染条件为感染复数(MOI)20,转染时间72 h,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,Western-blotting检测Notch3过表达效率;用羟脯氨酸试剂盒检测细胞上清羟脯氨酸含量,免疫荧光法检测CFs中α-SMA表达.结果:10 ng/ml TGF-β1可显著诱导CFs细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达增加,同时使Notch3表达下降,与空白对照组相比有统计学差异(P＜0.05).慢病毒转染CFs过表达Notch3后,与空白对照组相比,Notch3过表达组细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达均显著减少(P＜0.05).结论:过表达Notch3能抑制CFs向MFs转化.
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Notch3增强三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂的敏感性
目的:探讨干细胞相关因子Notch3在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂化疗敏感性中的作用.方法:用Lipofectamine 2000试剂转染乳腺癌MDA-MB-231细胞并用G418筛选稳定转染细胞系,根据转染质粒不同分为MDA-MB-231-PCLE组(对照组)和MDA-MB-23 1-N3ICD组(过表达Notch3组),应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测不同组间Notch3表达的差异;用CCK8法检测各组MDA-MB-231细胞对顺铂敏感性的差异;同时利用Lipofectamine 2000转染Notch3的小干扰序列,根据转染序列不同分为T47D-NC(对照组)和T47D-siNotch3(Notch3敲减组);采用免疫印迹检测Notch3表达改变后凋亡相关因子caspase-3的表达情况.结果:与对照组比较,高表达Notch3后三阴性乳腺癌对顺铂的敏感性增加(P＜0.05),同时caspase-3的表达随着Notch3的增加而增加,而在高表达Notch3的乳腺癌T47D细胞中,敲减Notch3的表达使caspase-3表达减少.结论:高表达Notch3可以增加三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞对顺铂的敏感性,从而增强患者化疗疗效.
