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丹酚酸B抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞增殖与分化的作用
目的:研究丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal-B)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的新生SD大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖与分化的影响,探讨Sal-B是否具有对抗心肌纤维化的作用.方法:胰酶消化,差速贴壁分离纯化CFs,抗波形蛋白免疫细胞化学法鉴定CFs.建立AngⅡ诱导的CFs增殖分化模型.实验分为空白组(无血清DMEM),模型组(1×10-6 mol· L-1AngⅡ),Sal-B低剂量组(2.5×10-5 mol· L-1 Sal-B+1×10-6 mol· L-1AngⅡ)及Sal-B高剂量组(5×10-5 mol· L-1Sal-B+1×10-6 mol· L-1 AngⅡ)共4组.Sal-B预保护1h,加入AngⅡ共同作用24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法分析Sal-B对AngⅡ诱导CFs增殖的细胞存活率,采用试剂盒(消化法)测定羟脯氨酸含量,蛋白质免疫印迹(Westernblot)分析α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)的表达情况.结果:MTT结果显示,与空白组比较,模型组AngⅡ显著诱导CFs异常增殖(P＜0.01),与模型组比较,Sal-B低、高剂量显著抑制AngⅡ诱导的CFs增殖(P＜0.01);羟脯氨酸含量测定结果显示,与空白组比较,模型组羟脯氨酸含量显著升高(P＜0.01),与模型组比较,Sal-B低、高剂量组含量均显著降低(P＜0.01);Western blot结果显示,与空白组比较,模型组α-SMA,Col Ⅰ蛋白表达显著上调(P＜0.01),与模型组比较,Sal-B低、高剂量组α-SMA,Col Ⅰ蛋白表达明显下调(P ＜0.05,P＜0.01).结论:Sal-B可抑制AngⅡ诱导的CFs增殖,减少α-SMA,Col Ⅰ蛋白的表达,对AngⅡ体外诱导心肌纤维化进程具有抑制作用.
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当归红芪超滤物对辐射后心肌成纤维细胞的增殖和胶原分泌的影响
目的:研究当归红芪超滤物对辐射后心肌成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响.方法:采用差速贴壁法原代分离培养大鼠心肌成纤维细胞;当归红芪超滤物干预或射线辐射心肌成纤维细胞后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞分泌I型胶原(COL-I )的含量;心肌成纤维细胞通过2', 7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色在流式细胞仪下检测活性氧(ROS)的含量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测心肌成纤维细胞中COL-I和转化生长因子-β(TGF-β)的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测相关蛋白的表达.结果:低剂量射线(0.5 Gy)辐射心肌成纤维细胞后,细胞内ROS的升高促进细胞增殖和胶原分泌的作用;当归红芪超滤物可以促进细胞中转录因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白的核转位来清除ROS,终抑制辐射诱导的心肌成纤维细胞的增殖和胶原分泌;并且当归红芪超滤物明显抑制心肌成纤维细胞中COL-I和TGF-βmRNA表达.结论:当归红芪超滤物可以抑制低剂量辐射诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原分泌.
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氧化苦参碱抑制p38MAPK磷酸化改善醛固酮诱导心肌成纤维细胞增殖
目的:研究氧化苦参碱(OMT)对醛固酮(ALD)诱导心肌成纤维细胞(CFs)增殖的作用,并分析其对p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)表达的影响.方法:采用胰酶消化差速贴壁法分离纯化SD新生大鼠CFs做原代培养,建立ALD诱导CFs增殖模型.实验分为空白组(无血清DMEM),ALD组(1×10-7 mol·L-1),OMT高、低剂量组(3.78×10-4,7.57×10-4mol· L-1).波形蛋白免疫细胞化学法鉴定CFs.采用噻唑蓝(MTT)法分析ALD对CFs增殖的量效与时效关系和OMT的抑制作用.实时荧光定量PCR分析p38MAPK mRNA的表达.Western blot分析p-p38MAPK,p38MAPK的蛋白表达.结果:MTT结果提示1×10-7 mol·L“ALD能够诱导CFs的增殖,且在24 h时增殖作用显著,7.57×10-4 mol· L-1 OMT可显著抑制CFs增殖.OMT对p38MAPK mRNA的水平无影响.OMT能够抑制p-p38MAPK蛋白的表达.结论:OMT可抑制ALD诱导CFs增殖的作用,其机制可能与抑制p38MAPK磷酸化有关.
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脱氢紫堇碱对高糖培养心肌成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响
目的：观察中药延胡索主要有效成分脱氢紫堇碱(DHC)对高浓度葡萄糖培养的心肌成纤维细胞(CFs)增殖和胶原分泌的影响,为延胡索的临床应用提供实验依据。方法采用体外高糖培养的CFs模型进行实验。以胶原酶与胰蛋白酶联合消化分离出生24 h内乳鼠CFs,取2～4代细胞高浓度葡萄糖(25 mmol/L)培养,分别加入100、50、25 mg/L DHC干预,24、48 h后镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA测定Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量。结果 CFs种植3 h后开始贴壁生长,高浓度葡萄糖培养液培养24、48 h后细胞增殖明显增加(P＜0.05,P＜0.01),48 h后S＋G2＋M期细胞的百分率明显增加(P＜0.01),细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原量明显升高(P＜0.01)；DHC干预后可显著抑制CFs增殖(P＜0.01),降低S＋G2＋M期细胞百分率(P＜0.01),减少Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05,P＜0.01)。结论 DHC能抑制高糖培养的CFs的增殖,减少胶原分泌,DHC具有潜在的抗心肌纤维化作用。
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氧化苦参碱下调p38MAPK磷酸化及改善胶原沉积抑制TGF-β1诱导的CFBs增殖
目的:研究氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞(CFBs)增殖的作用,并分析可能的作用机制.方法:试验分为空白对照组(无血清DMEM)、模型组(20 μg·L-1 TGF-β1)、OMT低剂量组(OMT-L组,1.89×10-4 mol·L-1)、OMT中剂量组(OMT-M组,3.78×10-4 mol·L-1)、OMT高剂量组(OMT-H组,7.56 ×10-4mol·L-1)和SB203580(p38MAPK阻断剂,1×10-5 mol·L-1).免疫细胞化学法鉴定CFBs中波形蛋白,测定TGF-β1诱导CFBs 24 h后α-SMA的表达情况;采用MTT法分析CFBs增殖的抑制作用;苦味酸天狼星红染色观察Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的沉积;Western blot分析p38MAPK,p-p38MAPK,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的表达.结果:MTT结果提示3.78×10-4,7.56×10-4mol·L-1的OMT对TGF-β1诱导的CFBs异常增殖具有抑制作用(P ＜0.01);α-SMA免疫细胞化学实验提示OMT能够抑制CFBs-myFBs转换;苦味酸天狼星红染色显示OMT能明显减少Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的沉积;Western blot表明OMT可以显著抑制TGF-β1诱导Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的沉积及p38MAPK的磷酸化(P＜0.01).结论:OMT可抑制TGF-β1诱导CFBs增殖的作用并抑制相关胶原蛋白的表达,改善心肌纤维化,其机制可能与抑制p38MAPK磷酸化有关.
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血脂康对血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响
心肌纤维化是导致心室顺应性和收缩功能下降而发生泵衰竭的一个重要因素,心肌纤维化主要是因为心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的活化、增殖及其所分泌的胶原增多与沉积所致.血脂康是从特制的中药红曲中经提炼精制而成的血脂调节剂,被称为中国人的"天然他汀".现有文献证明,血脂康具有诸多调脂以外的作用,如抗氧化、减轻血管炎症、抑制血管平滑肌增殖、稳定动脉粥样斑块、改善血管内皮功能、减轻左室质量[1]等,被广泛应用于心脑血管疾病的治疗中.
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醛固酮对新生大鼠心肌成纤维细胞PTEN表达的影响
目的 研究醛固酮(Ald)诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖中PTEN mRNA、蛋白表达及螺内酯(Spi)对其表达的影响,从而探讨Ald对心肌成纤维细胞PTEN表达的影响.方法 用体外培养新生SD大鼠的CFs,以Ald诱导其增殖和胶原合成,并加入Spi干预,用RT-PCR和Western Blot分别测定PTEN mRNA和蛋白表达.结果 与对照组相比,Ald组的CFs增殖和羟脯氨酸含量明显增加(P<0.05),并旱浓度依赖性降低PTEN mRNA和蛋白表达(P<0.05);与Ald组相比,Ald+Spi组的CFs增殖和羟脯氨酸含量明显减少(P<0.05),同时其PTEN mRNA、蛋白表达均明显升高(P<0.05).结论 醛固酮可通过盐皮质激素受体(MR)介导的基因组通路降低PTEN表达发挥其致心肌纤维化作用.
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Intermedin1-53抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞合成胶原
目的：探讨IMD1-53对血管紧张素Ⅱ（ AngⅡ）诱导的大鼠心肌成纤维细胞胶原代谢的调节作用。方法培养新生SD大鼠心肌成纤维细胞，将其分成对照组、AngⅡ＋不同浓度IMD1-53组。 Westem blot法检测心肌成纤维细胞Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达。 SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR检测IMD1-53受体样受体（ CRLR）和转化生长因子-β（ TGF-β） mRNA表达。结果 IMD1-53呈剂量依赖性抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白（P＜0.01，P＜0.05）。 IMD1-53呈剂量依赖抑制成纤维细胞TGF-β表达（P＜0.05）。结论 IMD1-53抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞胶原的合成，下调TGF-β表达，可能与IMD1-53抗心肌纤维化作用有关。
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TWEAK促进大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成
目的 探讨肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)对大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖和胶原合成的影响.方法 用胰酶消化法培养新生Wistar大鼠CFs,加入重组人TWEAK(rhTWEAK)干预48 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,qRT-PCR检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA,Western blot检测Ⅰ型胶原蛋白表达.结果 rhTWEAK作用后CFs的细胞数日明显增加,Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达上调,同时Ⅰ型胶原蛋白表达显著增强.结论 TWEAK具有促进大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的作用.
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阿托伐他汀抑制大鼠心肌成纤维细胞钙调神经磷酸酶的表达
目的 探讨钙调神经磷酸酶(CaN)在心肌纤维化中的作用及阿托伐他汀(Ato)抗心肌纤维化的机制.方法 采用体外新生SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)培养,以醛固酮(Ald)诱导其增殖和胶原合成,并加入Ato干预,应用RT-PCR和Western blot分别测定CaN mRNA和蛋白表达,并观察加入焦磷酸法尼酯(FPP)和焦磷酸牛儿基牛儿酯(GGPP)分别干预Ato对RAS和RHO蛋白的抑制作用.结果 Ald促进CFs增殖和增加羟脯氨酸含量,同时CaNmRNA和蛋白表达均升高,而Ato显著缓解上述变化.Ald+Ato+FPP组的CaNmRNA和蛋白表达均高于Ald+Ato组.结论 Ato可通过CaN依赖的信号通路抑制Ald诱导的心肌纤维化,其作用与Ato通过甲羟戊酸通路抑制RAS蛋白活性有关.
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促红细胞生成素抑制TGF-β诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖
目的 探讨促红细胞生成素在大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖中的作用.方法 培养大鼠CFs.实验分为对照组(control)、TGF-β刺激组(TGF-β终浓度为5μg/L)和重组人促红细胞生成素(rhEPO,5 000 U/L)干预组:1h后加入TGF-β.24 h后计数细胞并采用MTT法观察细胞增殖;免疫细胞化学及Western blot法检测α-SMA表达,观察细胞转化;羟脯氨酸定量检测细胞胶原含量;Western blot法检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及MMP-2、MMP-9表达.结果 与对照组比较,TGF-β使细胞明显增殖(P＜0.05),Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成(P＜0.05)、α-SMA表达(P＜0.05)、细胞MMP-2、MMP-9表达增多(P＜0.05).使用重组人促红细胞生成素(rhEPO)干预后,CFs增殖、α-SMA表达及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成较TGF-β组均显著降低(P＜0.05),MMP-2、MMP-9表达进一步增多(P＜0.05).结论 生理剂量EPO可抑制TGF-β诱导的大鼠CFs增殖、转化及胶原的合成,促进胶原降解.
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JNK信号通路介导高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖
目的 明确C-JUN氨基末端激酶(JNK)信号通路在高糖诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖中的作用.方法 提取大鼠原代心肌成纤维细胞,观察不同糖浓度(12、18和25 mmol/L葡萄糖)和不同刺激时间(0、12、24和48 h)对JNK通路的影响.实验分为对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、JNK抑制剂SP600125组(25 mmol/L葡萄糖+SP600125 10、20μmol/L)和高渗组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)培养48 h,应用MTT测定细胞增殖、Weastern blot测定JNK磷酸化水平和增殖细胞核抗原(PCNA)的蛋白表达、RT-PCR检测C-JUN基因表达.结果 高糖呈时间和剂量依赖性增加JNK磷酸化水平.与对照组比较,高糖显著地促进了心肌成纤维细胞的增殖(0.44±0.02 vs 0.31±0.02,P＜0.01),并上调了C-JUN的基因表达和PCNA蛋白水平.SP600125能够浓度依赖性地抑制高糖诱导的细胞增殖和JNK通路的激活.结论 JNK信号通路部分地介导了高糖诱导的大鼠心肌成纤维细胞增殖.
关键词： 葡萄糖 心肌成纤维细胞 增殖 c-Jun氨基末端激酶 -
慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白载体转染大鼠心肌成纤维细胞
目的 探讨慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白(LV-SDF-1 α-GFP)对心肌成纤维细胞影响,佳感染条件及目的蛋白表达和分泌特点.方法 差速贴壁法分离培养乳大鼠心肌成纤维细胞,观察和免疫荧光鉴定.不同滴度及条件的LV-SDF-1 α-GFP转染心肌成纤维细胞,观察荧光表达,探索佳转染条件.LV-SDF-1α-GFP目的基因病毒以及阴性对照CON145病毒的转染心肌成纤维细胞,绘制生长曲线,探索转染对心肌成纤维细胞的增殖有无明显影响.利用佳转染剂量组转染心肌成纤维细胞,斑点印迹法(Dot blotting)检测SDF-1 α目的蛋白分泌.计量资料进行统计学分析.结果 心肌成纤维细胞具很高活性,传至4代纯度高,折光度好,无自发性搏动.LV-SDF-1 α-GFP佳转染感染复数(MOI)值为10,添加感染增强液,聚凝胺组感染效果好,效率达80％.LV-SDF-1 α-GFP组以及阴性对照CON145组对心肌成纤维细胞毒性作用小,细胞形态无明显变化,与非转染组生长曲线相似,差异无统计学意义(P＞0.05).转染LV-SDF-1 α-GFP的心肌成纤维细胞培养至第4天SDF-1α蛋白分泌量达高值,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 LV-SDF-1 α-GFP载体对心肌成纤维细胞具很高的转染效率,细胞毒性小,并能够分泌SDF-1α目的蛋白.
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新生大鼠心肌成纤维细胞的内皮细胞分化潜能
目的 探讨心肌成纤维细胞(CFs)向内皮细胞分化以及成血管潜能.方法 新鲜左心室组织,体外分离、培养、纯化CFs,利用内皮细胞诱导液对第3代CFs诱导培养,连续诱导培养28 d后,换用内皮细胞培养基(ECM),并消化传代扩增至第3代.观察诱导细胞生长情况和形态变化,利用免疫细胞化学法、流式细胞术和血管形成分析实验对诱导后细胞的内皮细胞标志物的表达和功能特性进行评价.结果 新生大鼠第3代CFs,呈三角形、梭形和多边形,增殖速度迅速;波形蛋白(vimentin)、盘状结构受体2(DDR2)均呈阳性表达.诱导第3天细胞开始汇合,21 d部分细胞形成串珠样连接,28 d出现细胞汇集成环状样形状;免疫组织化学标记vWF和CD31呈阳性表达;细胞免疫荧光标记vWF、CD34、CD105均呈阳性表达;流式细胞术检测诱导后细胞表面标志物CD31表达率为50.5％,对照组CD31表达率为5.82％.结论 血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)体外定向诱导CFs可使其向血管内皮细胞分化,并表现其功能特征.
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Furin基因对高血压心肌梗死细胞增殖、迁移以及作用机制的研究
目的 初步探索Furin与心肌成纤维细胞增殖、迁移的关系以及作用机制.方法 RNAi技术沉默心肌成纤维细胞中Furin基因的表达,分为空白对照组、阴性对照组(转染siRNA-NC)和Furin干扰组(转染siRNA Furin).四甲基偶氮唑(MTT)实验检测细胞增殖的情况,Transwell法检验细胞的迁移能力,采用荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测Furin、α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col-1)mRNA、蛋白水平.结果 Furin干扰组心肌成纤维细胞中Furin mRNA、蛋白的表达量均显著低于空白对照组(P＜0.05),阴性对照组与空白对照组差异无显著性(P＞0.05).沉默Furin表达显著抑制细胞的增殖和迁移(P＜0.05),显著下调Col-1、α-SMA的表达水平(P＜0.05),阴性对照组细胞增殖、迁移与空白对照组差异无显著性(P＞0.05).结论 沉默Furin能通过抑制心肌成纤维细胞增殖、迁移、胶原合成,增加细胞外基质分解和抑制细胞外基质沉积,降低心肌梗死过程中的心肌纤维化过程.
关键词： 心肌成纤维细胞 Furin α-平滑肌细胞肌动蛋白 Ⅰ型胶原 -
PKCα对AngⅡ作用的心肌成纤维细胞增殖活性和NO分泌的影响
目的 探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用后的心肌成纤维细胞增殖活性和一氧化氮(NO)分泌的影响.方法 分离培养乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组(正常培养)、AngⅡ组(AngⅡ处理)、实验组(PKCα抑制剂D4681和AngⅡ处理).实时定量PCR和Western blot法测定细胞中的PKCα mRNA和蛋白水平.用PKCα抑制剂和AngⅡ共同处理心肌成纤维细胞,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖活性,硝酸还原法测定细胞分泌的NO水平,酶联免疫吸附(ELISA)法测定培养液中的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)含量,羟脯氨酸法测定细胞合成胶原蛋白水平,Western blot法测定各组细胞表达基质金属蛋白酶－1(MMP－1)、基质金属蛋白酶－2(MMP－2)、Ⅰ型胶原(COLLⅠ)、Ⅱ型胶原(COLLⅡ)水平.结果 AngⅡ组心肌成纤维细胞中的PKCα mRNA和蛋白水平均明显高于对照组(P ＜0.05).AngⅡ组心肌成纤维细胞增殖活性升高,细胞分泌的NO含量和iNOS活性均下降,细胞合成胶原蛋白水平升高,细胞中的MMP－1、MMP－2蛋白水平下降,COLLⅠ、COLLⅡ蛋白水平升高,与对照组相比差异具有统计学意义(P ＜0.05).实验组心肌成纤维细胞增殖活性降低,细胞分泌的NO含量和iNOS活性升高,胶原蛋白合成减少,细胞中MMP－1、MMP－2蛋白表达增多,COLLⅠ、COLLⅡ蛋白表达减少,与AngⅡ组相比差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 PKCα在AngⅡ作用后的心肌成纤维细胞中表达升高,抑制PKCα可以减弱AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖作用,促进细胞分泌NO.
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人参皂苷Rg1抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成
目的 探讨人参皂苷Rg1对高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响.方法 体外分离培养心肌成纤维细胞,分为正常组(用正常细胞培养液培养)、高糖组(用D葡萄糖浓度为30 mmol/L的细胞培养液培养)和人参皂苷Rg1组(用含有D葡萄糖浓度为30 mmol/L、人参皂苷Rg1浓度为50 mg/L的细胞培养液培养),培养48 h后,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,羟脯氨酸法检测羟脯氨酸含量间接反映胶原蛋白合成水平,Western blot检测细胞中转化生长因子(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达水平.结果 高糖组细胞存活率、细胞G0+G1期比率、羟脯氨酸含量、TGF-β1表达均明显高于正常组,而MMP-1、MMP-2明显低于正常组(P＜0.01).人参皂苷Rg1组细胞存活率、细胞G0+G1期比率、羟脯氨酸含量、TGF-β1均明显低于高糖组,而MMP-1、MMP-2明显高于高糖组(P＜0.01).结论 人参皂苷Rg1能够抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞细胞增殖和胶原合成.
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心肌营养素1对心肌成纤维细胞增殖的作用机制
目的 探讨在高静水压条件下心肌营养素1(CT-1)对成纤维细胞增殖作用机制.方法 3～4代心肌成纤维细胞用于实验,分为对照组、助溶剂(二甲亚砜,DMSO)组、CT-1反义寡核苷酸组(ASODN)、正义寡核苷酸组(SODN)、MEK-EPK阻断剂PD98059组、JAK-STAT3阻断剂AG490组、PI3K阻断剂LY294002.利用自制压力培养装置,将各组细胞置于160 mm Hg压力下培养8 h. STAT3、ERK1/2和PI3-K的活性通过Western blot分析测定;MTT测定心肌成纤维细胞增殖.结果 高静水压明显促进心肌成纤维细胞增殖,CT-1表达上调,CT-1ASODN干预后,CT-1ASODN能抑制高静水压所致的细胞增殖,吸光度值(A值)为(0.132±0.013 vs 0.154±0.011,P＜0.05),STAT3(2.09±0.25 vs 2.47±0.28, P＜0.05)、ERK1/2(1.13±0.19 vs 1.61±0.22, P＜0.05)和PI3-K(1.25±0.23 vs 1.71±0.25,P＜0.05),蛋白表达水平明显低于对照组.AG490组明显减弱高静水压的促增殖作用(0.118±0.018 vs 0.155±0.010,P＜0.05);PD98059增强高静水压的促增殖(0.185±0.011 vs 0.155±0.010,P＜0.05),PI3-K阻断剂LY294002干预后对高静水压的促增殖作用无影响(0.157±0.015 vs 0.155±0.010,P＞0.05);SODN与对照组相比对心肌成纤维细胞增殖无明显影响.结论 高静水压下,可以激活STAT3、ERK1/2、PI3-K信号通路,心肌成纤维细胞增殖主要通过STAT3通路;ERK1/2通路起负向调节作用;PI3-K 与细胞增殖关系不是很密切.
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结合转录因子激活蛋白1的诱杀性寡聚脱氧核苷酸能抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞胶原表达
目的 探讨结合转录因子激活蛋白1的诱杀性寡聚脱氧核苷酸(AP-1 decoy ODNs)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型及Ⅲ型胶原的影响,为高血压心肌纤维化的防治提供理论依据.方法 采用羟脯氨酸比色法测定SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)上清胶原合成,分别观察不同浓度的AP-1 decoy ODNs对AngⅡ诱导的CFs胶原的合成、Ⅰ型及Ⅲ型mRNA的影响.结果 ①10-7mol/L Ang Ⅱ刺激24 h后能够显著增加CFs胶原合成,decoy ODNs在10～200 nmol/L范围内量-效相关地抑制CFs胶原合成,但突变的decoy ODNs对CFs的增殖、胶原合成没有明显的影响.②10-7mol/L Ang Ⅱ作用24 h后能够显著使CFs Ⅲ型(1.04±0.07比1.63±0.07,n=3,P<0.05)和Ⅰ型(1.09±0.09比0.20±0.10,n=3,P<0.05)基因表达上调,而100 nmol/L(Ⅰ型0.45±0.05和Ⅲ型0.84±0.04)、200 nmol/L(Ⅰ型0.22±0.06和Ⅲ型0.61±0.07)的AP-1 decoy ODNs(P<0.05)能够抑制这种作用.突变的AP-1 decoy ODNs没有此作用.结论 AP-1 decoy ODNs通过抑制Ang Ⅱ诱导的CFs Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达,从而抑制胶原的合成.
关键词： 心肌成纤维细胞 激活蛋白1 decoy寡聚脱氧核苷酸 血管紧张素Ⅱ 胶原 -
RNA干扰选择性下调心肌成纤维细胞结缔组织生长因子
目的 研究RNA干扰技术能否选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)及其诱导的下游纤维化成分的表达.方法 利用差速贴壁法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞.用携带U6启动子和CTGF特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体CTGF-shRNA,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒CTGF-con以lipofectamine TM2000为载体转染原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞.加入含G418的DMEM培养液培养一月筛选后获得稳定转染的细胞.通过半定量RT-PCR检测细胞内转化生长因子(TGF-β1),CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达,Western-blot法检测细胞内CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达.结果 CTGF在心肌成纤维细胞中有基础表达,并在转化生长因子β1(TGF-β1)刺激下其含量增加,CTGF-shRNA使心肌成纤维细胞CTGF的mRNA和蛋白质的表达分别降低65%和78%,FN的mRNA和蛋白质的表达分别降低81%和63%,而TGF-β1mRNA的表达上调32%.转染对照质粒组较空白对照组与脂质体组CTGF,FN表达量差异无统计学意义.结论 RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞CTGF及下游纤维化成分FN的表达,进一步为拮抗心肌纤维化的基因治疗提供了依据.
