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白藜芦醇延缓心肌微血管内皮细胞衰老的作用机制
目的:探讨白藜芦醇延缓人心脏微血管内皮细胞衰老的作用,从细胞骨架角度分析其作用机制.方法:通过热休克蛋白27(HSP27) shRNA细胞系的建立,将组别为8代复制性衰老模型组(衰老组),白藜芦醇组(10 μmol·L-1),空载质粒(Mock)组,HSP27shRNA组,HSP27shRNA+白藜芦醇组(10 μmol·L-).运用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老,细胞计数(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力,激光免疫共聚焦显微镜观察纤维状肌动蛋白(F-actin)和球型蛋白单体(G-actin)的形态学改变,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测F-actin蛋白的表达情况.结果:与衰老组比较,白藜芦醇组β-半乳糖苷酶染色比例下降(P＜0.01),细胞增殖能力增加(P＜0.01),F-actin线条较为完整的分布于细胞边缘,G-actin圆润饱满的分布于细胞中央,蛋白表达减少(P＜0.01);热休克蛋白27 (heat shock protein 27,HSP27)沉默后,与Mock组比较,HSP27shRNA组及HSP27shRNA+白藜芦醇组β-半乳糖苷酶染色比例增加(P＜0.01),细胞增殖能力下降(P＜0.01),F-actin外周致密带边缘变得毛糙不规整,崩解消散,细胞的形状不能清晰的呈现;G-actin表现为边缘变模糊呈絮状向外延伸,而细胞中央区域染色离散,形态不规则,F/G-actin的平均光密度值下降(P＜0.01),蛋白表达减少(P＜0.01).结论:白藜芦醇能够延缓内皮衰老,促进增殖,其中HSP27下调F-actin的表达可能是白藜芦醇延缓内皮衰老的重要机制所在.
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芦荟大黄素对肝癌HepG2细胞生长、迁移及纤维状肌动蛋白的影响
目的:探讨芦荟大黄素对肝癌HepG2细胞生长、迁移及纤维状肌动蛋白(F-actin)的影响.方法:通过对人正常肝细胞株QSG-7701细胞的药物毒性实验筛选出芦荟大黄素对人正常肝细胞无明显毒性的大无毒浓度(TC0);以TC0为高浓度并稀释成3个不同的芦荟大黄素浓度,作用于体外培养人肝癌HepG2细胞为芦荟大黄素组,另设置未加药物HepG2细胞为空白组;通过噻唑蓝(MTT)比色法检测两组细胞作用48 h后细胞增殖抑制率;采用细胞小室移动实验及划痕实验检测两组细胞迁移能力;高内涵细胞成像系统分析芦荟大黄素对HepG2细胞F-actin表达的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS),核转录因子-κB p65(NF-κB p65)蛋白表达.结果:芦荟大黄素对人正常肝细胞株QSG-7701细胞的TC0为50μmol·L-1,以TC0为高浓度,将芦荟大黄素(10,30,50 μmol·L-1)作用于HepG2细胞;与空白组相比,芦荟大黄素组细胞培养48 h后增殖抑制率升高,且呈剂量递增型(P＜0.01);芦荟大黄素组细胞培养48 h后划痕距离增宽,迁移能力降低,且呈剂量递减型(P＜0.01);F-actin面积缩小,排列紊乱且不规则,边缘模糊,且呈浓度递减型(P＜0.01);芦荟大黄素组细胞NF-κB p65表达增多,p-eNOS表达减少,且呈浓度递减型(P＜0.01).结论:芦荟大黄素可能通过增强NF-κB p65,降低p-eNOS表达,促进F-actin解聚,减少微丝形成,从而降低肝癌HepG2细胞的增殖和迁移能力,发挥其抑制肿瘤的作用.
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人参三七川芎提取物对复制性衰老内皮细胞微丝形态学的影响
目的 探讨人参三七川芎提取物延缓内皮衰老的可能作用机制.方法 通过细胞体外传代,将人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)培养至第8代方法建立内皮细胞复制性衰老模型,结合β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、CCK-8检测细胞增殖能力、流式细胞仪分析细胞周期方法进行衰老细胞鉴定.96孔板按照6×103～8×103/孔接种细胞,分为青年组、衰老组、白藜芦醇组和中药低、中、高剂量组,每组3个复孔.青年组为5代青年细胞,其余各组为8代复制性衰老细胞,白藜芦醇组加浓度为10 μmol/L白藜芦醇溶液100μl,中药低、中、高剂量组分别加浓度为50、100、200 mg/L的人参三七川芎提取物100μl.观察各组24h、48h、72h后纤维状肌动蛋白(F-actin)、单体肌动蛋白(G-actin)的形态学改变.结果 衰老组细胞SA-β-gal染色阳性明显高于青年组(P＜0.01);衰老组较青年组细胞表现为G0/G1期细胞比例上升,S期和G2/M期细胞比例下降,细胞增殖能力降低(P＜0.01).衰老组F-actin出现断裂、应力纤维,G-actin表现为向细胞周边区域伸展移位,而细胞中央区域染色变弱;白藜芦醇组和中药低、中、高剂量组可以维持复制性衰老HCMEC微丝的结构,减少G-actin向F-actin的转变,减少应力纤维的形成,并且干预效果随着干预时间延长表现更加明显.结论 人参三七川芎提取物能够保持复制性衰老HCMEC微丝的正常形态,这可能是其延缓内皮衰老的重要机制.
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虎杖苷对内毒素刺激下多形核白细胞纤维状肌动蛋白的影响
目的:观察虎杖苷对内毒素刺激下多形核白细胞(Polymorphonuclear leukocytes,PMN)骨架蛋白变化的影响,探讨虎杖苷(Polydatin,PD)治疗炎症、感染性休克的机制.方法:以流式细胞仪及共聚焦显微镜观察虎杖苷对内毒素刺激下罗丹明-鬼笔环肽(Rhodamine-Rhalloidin)标记纤维状肌动蛋白(F-actin)的变化.结果:在LPS刺激作用下,PMN F-actin含量明显下降至正常时的80±0.02%(P＜0.05),在LPS刺激后再用PD治疗,其F-actin又上升至正常的89±0.02%(P＜0.05).在正常情况下,PMN中F-actin主要分布于细胞膜附近,形成一层较为致密的骨架,支撑起细胞的形状.在LPS刺激后,F-actin在细胞边缘形成一宽厚的骨架层,同时发现该层分布不均匀,提示在一些部位可能会有伪足形成.LPS刺激后再用PD治疗,发现细胞边缘的F-actin较LPS刺激时明显减少,而中央相对增加.结论:PD可能通过抑制LPS对细胞骨架蛋白F-actin的影响发挥抗炎症性休克的作用.
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microRNA-32在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中表达临床意义
目的 研究microRNA-32 (miR-32)在肾透明细胞癌(SE)患者肿瘤组织中表达及与SE病理分级的关系.方法 选择76例于青海大学附属医院泌尿外科收治的SE患者,其中男性48例,女性28例;年龄38 ～ 65岁,平均年龄53.44岁;TNM分期,Ⅰ期14例,Ⅱ期20例,Ⅲ～Ⅳ期42例;肿瘤直径＜4 cm 44例,≥4 cm 32例.取手术后病灶组织和癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-32、miR-21在肿瘤组织及癌旁组织中的表达,分析miR-32与SE患者病理特征的关系;采用Pearson相关性检验分析miR-32与miR-21相关性;采用Western blot检测SE组织及癌旁组织中纤维状肌动蛋白(F-actin)、磷酸酶张力蛋白同源基因(PTEN)、波形蛋白(vimentin)的表达.结果 SE患者肿瘤组织中miR-32,miR-21表达明显高于癌旁组织(P＜0.05);与肿瘤直径＜4cm相比,SE患者肿瘤直径≥4 cm肿瘤组织中miR-32表达升高,且随TNM分期升高而升高.Pearson相关性分析结果显示肿瘤组织中miR-32与miR-21表达呈正相关(r=0.627,P＜ 0.05).与癌旁组织相比,SE肿瘤组织中F-actin、vimentin表达升高,PTEN表达降低(P＜0.05).结论 miR-32在SE肿瘤组织中呈高表达,并且与肿瘤直径、临床分析密切相关,其机制可能与miR-32可促进SE细胞迁移有关.
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F-actin重构对树突状细胞形态和功能影响的研究进展
树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前发现的有效的抗原提呈细胞,在启动和放大先天性及适应性免疫应答中发挥重要的作用.在其整个生命过程中,它的细胞形态、迁移与黏附、抗原捕获及抗原提呈等多方面与细胞骨架的动态重构存在密切的关系.细胞骨架的动态重构是一个由多种细胞骨架蛋白共同参与调节的复杂的结构体系,随着研究的不断深入,人们对这种结构体系的认知越来越清晰.基于这些研究,本文综述了纤维状肌动蛋白(Filamentous actin,F-actin)重构对树突状细胞形态和功能的影响.
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丁苯酞对慢性酒精中毒大鼠海马内硫化氢和纤维状肌动蛋白的影响
目的：探究丁苯酞（NBP）对慢性酒精中毒大鼠学习记忆能力、海马内硫化氢（H2S）和纤维状肌动蛋白（F-actin）含量的影响。方法将50只SD雄性大鼠随机分为5组，除对照组外，将含酒的水作为大鼠唯一水来源，并逐渐增加酒精含量，采用自由饮用方法建立慢性酒精中毒模型。42 d后按慢性酒精中毒大鼠戒断评分表于末次饮酒后6 h检测大鼠模型，NBP低、中、高剂量组大鼠灌胃不同剂量NBP（大约14 d），饮酒结束后利用Y型电迷宫测试酒精中毒大鼠的学习记忆能力，随后检测海马组织H2S和F-actin的含量。结果与对照组大鼠学习记忆成绩（40.38±5.97）、H2S含量（23.25±3.61）和F-actin在阳性细胞中的表达相比，模型组大鼠学习记忆成绩（83.25±5.47）和H2S含量（43.86±6.95）均升高，F-actin的阳性表达降低（P＜0.01）。与模型组大鼠相比，NBP中、高剂量组大鼠学习记忆成绩（64.75±4.71）、（70.00±4.72）和H2S含量（32.21±5.32）、（36.78±7.29）nmol／g均降低，F-actin的阳性表达升高（P＜0.01）。结论 NBP能够减轻慢性酒精中毒大鼠对酒精的依赖，缓解酒精对大鼠学习记忆能力的影响，可能与NBP影响H2 S和F-actin的含量有关。
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一种简易的平行板流动腔系统的应用
为了解切应力对培养内皮细胞的生物学作用,我们建立了一种简易的平行板流动腔系统,通过本系统可以产生0～48dyn/cm2的稳定层流切应力,应用本系统观察了切应力对内皮细胞形态、纤维状肌动蛋白(F-actin)及球状肌动蛋白(G-actin)的影响,结果发现在12h作用时间内,12、24、48dyn/cm2切应力作用下,可见细胞中央顺细胞长轴排列的应力纤维(F-actin)逐渐演变为顺血流方向排列,F-actin的含量逐渐增多,G-actin含量逐渐减少,而细胞形态无显著改变.表明这种简易平行板流动腔系统培养的内皮细胞受到的切应力作用是确实可靠的.
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肌球蛋白轻链磷酸化在腹泻型IBS大鼠肠黏膜屏障功能障碍中的作用
背景：肌球蛋白轻链（ MLC）是调控细胞间紧密连接和肠道通透性的启动因子，磷酸化MLC（ pMLC）可引起紧密连接相关蛋白重新分布，破坏紧密连接结构和完整性，终引起肠黏膜屏障功能障碍。目的：探讨MLC磷酸化在腹泻型IBS（ IBS-D）大鼠肠黏膜屏障功能障碍中的作用。方法：将8只Sprague-Dawley孕鼠随机分为模型组和对照组，采用母婴分离法构建IBS-D大鼠模型。记录大鼠造模成功后1 h内粪便性状和颗粒数，采用腹壁回撤反射（ AWR）评分评估大鼠内脏敏感性，免疫荧光法观察结肠组织纤维状肌动蛋白（ F-actin）、细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、claudin-1的分布，蛋白质印迹法检测肠黏膜MLC、pMLC、F-actin、ZO-1、claudin-1蛋白的表达，透射电镜观察细胞间紧密连接。结果：与对照组相比，模型组内脏敏感性显著升高；免疫荧光法显示claudin-1荧光强度减弱，结构紊乱，重新分布，F-actin和ZO-1结构模糊；蛋白质印迹结果显示pMLC/MLC比值和pMLC表达明显升高，claudin-1表达明显降低，MLC、F-actin和ZO-1表达无明显差异；透射电镜显示细胞紧密连接破坏，细胞间隙扩大。结论：MLC磷酸化水平升高介导细胞骨架蛋白F-actin重组，引起细胞紧密连接蛋白结构和功能的改变，细胞间隙增加，导致肠黏膜屏障功能障碍，在IBS-D的发病中发挥重要作用。
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利用Lifeact法检测恶性疟原虫F-actin的研究
目的 通过构建游离表达绿色荧光蛋白融合Lifeact多肽(Lifeact-GFP)的转基因虫株,在不影响恶性疟原虫actin动态平衡的前提下特异标识纤维状肌动蛋白(F-actin),为研究F-actin在恶性疟原虫中的特性及其对毒力基因的转录调控作用打下基础.方法 构建重组转染质粒Lifeact-GFP/pLN,经电转化方法将质粒转入恶性疟原虫3D7标准虫株中,BSD药物筛选获得携带游离Lifeact-GFP/pLN质粒的转基因虫株,并经免疫印迹(Western Blot)和活细胞荧光检测,证实Lifeact-GFP融合基因的细胞内表达,以期通过免疫共沉淀实验(Co-IP)检测Lifeact与恶性疟原虫F-actin的相互作用.结果 成功获得了恶性疟原虫Lifeact-GFP转基因虫株,并通过Westem Blot和荧光检测证实Lifeact-GFP成功获得表达;但是,免疫共沉淀实验结果初步显示,Lifeact不能直接结合恶性疟原虫F-actin.结论 虽然Lifeact多肽能在酵母等细胞中特异结合F-actin,但是不能直接识别恶性疟原虫F-actin.
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吗啡依赖大鼠不同脑区肌动蛋白及其结合蛋白的表达变化
目的 研究吗啡依赖大鼠不同脑区肌动蛋白及其结合蛋白p-cofilin的表达变化.方法 42只♂ SD大鼠,随机分为吗啡依赖1周组(M1组)、2周组(M2组)和4周组(M4组),各依赖组均设对照,每组7只.吗啡依赖组采用剂量递增法腹腔注射吗啡,每日3次,连续7 d,日剂量按5,10,15,20,30,40,50 mg·kg-1逐日递增,对照组给与等体积的生理盐水.M2和M4组大鼠继续分别给予50 mg·kg-1盐酸吗啡,每天1次,连续注射1或3周.在后一次给药后5 h断头处死大鼠,迅速分离前额叶皮质、海马、纹状体和丘脑.Western blot检测吗啡依赖大鼠不同脑区肌动蛋白及其结合蛋白的表达变化.结果 与对照组相比,M2和M4组大鼠前额叶皮质内F-actin/G-actin比值分别上调53%(P<0.05)和102%(P<0.01);M2和M4组大鼠前额叶皮质内p-cofilin表达量分别上调93% (P<0.01)和88%(P<0.01).M4组大鼠海马中F-actin/G-actin比值上调94%;M2和M4组大鼠海马中p-cofilin蛋白表达量分别上调45%(P<0.05)和30%(P<0.05).M2和M4组大鼠纹状体内p-cofilin的蛋白表达量分别下调25%(P<0.05)和30%(P<0.05).结论 长期吗啡处理可诱导大鼠形成依赖,伴随着依赖相关脑区肌动蛋白重构,并呈现脑区特异性和时间依赖性.
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丁苯酞对慢性酒精中毒大鼠海马线粒体及学习记忆能力的影响
目的 探讨丁苯酞(n?butylphthalide,NBP)对慢性酒精中毒大鼠海马线粒体和学习记忆能力的影响.方法 60只SD雄性大鼠随机均分为正常对照组、模型组和治疗组,每组20只.模型组和治疗组大鼠连续给予6％(V/V)酒精溶液28 d,建立慢性酒精中毒大鼠模型,治疗组大鼠在给予酒精溶液第14天开始给予丁苯酞灌胃,灌胃14 d.采用Y型电迷宫测试大鼠的学习记忆能力,分光光度法测海马组织H2 S的含量和线粒体ATP酶活性,Western blot检测海马F?actin的蛋白表达量.结果 与正常对照组大鼠比较,模型组大鼠学习记忆能力下降,海马组织H2 S含量升高,线粒体ATP酶活性和F?actin蛋白表达均降低,电镜下大部分线粒体有损伤.经丁苯酞治疗后,治疗组大鼠的训练次数[(61.88±3.61)次]较模型组[(82.19±4.87)次]降低,学习记忆能力提高(P<0.05),治疗组大鼠海马线粒体ATP酶活性[(1.84±0.11)U/mgprot]和F?actin蛋白(0.12±0.01]表达较模型组[(1.50±0.07)U/mgprot,(0.08±0.01)]均升高,差异有统计学意义(均P<0.05).治疗组大鼠海马组织H2 S含量[(34.56±2.47)nmol/g]较模型组[(44.55±3.71)nmol/g]降低,差异有统计学意义(P<0.05),电镜下线粒体损伤有所改善.结论 NBP能改善慢性酒精中毒大鼠的线粒体损伤和学习记忆能力.
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血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞骨架的损伤作用
目的 探讨血管紧张素Ⅱ对内皮细胞肌动蛋白骨架的影响及其作用机制.方法 血管紧张素Ⅱ(10-6mol/L)处理人脐静脉内皮细胞不同时间(0、5、15、30及60 min).激光共聚焦显微镜下观察细胞纤维状肌动蛋白骨架的形态学变化.Western blotting检测丝裂原活化蛋白激酶磷酸化水平.结果 正常组内皮细胞的纤维状肌动蛋白主要富集于细胞膜周边,分布均匀.血管紧张素II处理组细胞膜周边的纤维状肌动蛋白消失,胞浆中出现密集的应力纤维,细胞间隙形成,且呈明显的时间依赖性.血管紧张素Ⅱ上调p38丝裂原活化蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和热休克蛋白27的磷酸化水平,但对细胞外信号调节激酶无明显影响.p38丝裂原活化蛋白激酶特异性抑制剂SB203580阻断血管紧张素Ⅱ引起的纤维状肌动蛋白重排和细胞间隙形成.c-Jun氨基末端激酶特异性抑制剂SP600125则无明显作用.结论 血管紧张素Ⅱ通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶/热休克蛋白27信号通路引起内皮细胞的纤维状肌动蛋白重排,导致细胞骨架损伤.
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葡萄糖转运蛋白4及其下游信号分子在高糖刺激下肾小球系膜细胞中的作用
目的 探讨高糖和胰岛素对肾小球系膜细胞(GMC)葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)和Cbl相关蛋白(CAP)的mRNA表达及细胞骨架纤维状肌动蛋白F-actin的影响,探讨糖尿病肾病发生发展中GLUT4及其下游分子F-actin和CAP的重要作用.方法 将细胞分为8组:正常对照组、生理浓度胰岛素(10-9 mol/L)组、低浓度胰岛素(10-8 mol/L)组、高浓度胰岛素(10-6mol/L)组、高糖(30 mmol/L)组、甘露醇组(25 mmol/L 甘露醇+5 mmol/L葡萄糖)、高糖加高浓度胰岛素组、高糖加生理浓度胰岛素组.采用RT-PCR法和免疫组化法,观察不同情况下GMC中GLUT4蛋白和mRNA以及CAP mRNA的表达及其变化.Rhodamine-phalloidin染色和激光共聚焦显微镜观察F-actin形态及荧光强度.结果 正常对照组GMC中GLUT4蛋白和mRNA以及CAP mRNA有一定表达,而生理浓度胰岛素组与正常对照组差异均无统计学意义.高糖组GLUT4蛋白(P<0.01)和mRNA(P<0.05)以及CAP mRNA(P<0.01)表达均显著减少,F-actin解聚增加(P<0.01);而甘露醇组以上各指标与对照组差异均无统计学意义.低浓度胰岛素组和高浓度胰岛素组GLUT4 mRNA表达分别为生理浓度胰岛素组的2.06倍和2.66倍,GLUT4蛋白表达分别为对照组的1.93倍和2.83倍,CAP mRNA表达分别为对照组的1.91倍和2.15倍,F-actin荧光强度分别为对照组的1.296倍及1.224俯,均呈一定的浓度依赖性.高糖加高浓度胰岛素组GLUT4 mRNA表达为高糖组的2.15倍(P<0.05),GLUT4蛋白表达为高糖组的2.08倍(P<0.01),CAP mRNA表达为高糖组的2.14倍(P<0.01),F-actin荧光强度为高糖组的1.838倍(P<0.01).GI-UT4 mRNA与CAP mRNA呈正相关(r=0.905,P=0.002);GLUT4与F-actin呈止相关(r=0.929,P=0.001).结论 (1)正常GMC中GLUT4 mRNA与蛋白、CAP mRNA有一定表达.(2)高糖可抑制GLUT4的蛋白和mRNA以及CAP mRNA表达,促进F-actin解聚.(3)胰岛素能部分拮抗高糖导致系膜细胞中GLUT4的蛋白和mRNA以及CAP mRNA表达的下调作用.(4)GLUT4、CAP和F-actin是糖尿病肾病发生发展的重要影响因子之一.
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高糖和胰岛素对肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白4 mRNA表达及细胞骨架纤维状肌动蛋白的影响
目的探讨高糖和胰岛素对肾小球系膜细胞(GMC)葡萄糖转运蛋白4(GluT4)mRNA表达及细胞骨架纤维状肌动蛋白(F-actin)的影响,进一步研究糖尿病肾病发生发展中GluT4及其下游分子F-actin的重要作用.方法将培养的鼠1097系膜细胞分为8组:正常对照组,生理浓度胰岛素组(10-9mol/L),低浓度胰岛素组(10-8mol/L),高浓度胰岛素组(10-6mol/L),高糖组(30 mmol/L),甘露醇组,高糖加高浓度胰岛素组,高糖加生理浓度胰岛素组.采用RT-PCR法检测GluT4mRNA含量,rhodamine-phalloidin染色,激光共聚焦显微镜观察F-actln形态并测定荧光强度.结果(1)正常系膜细胞可检测到GluT4 mRNA.(2)高糖组GluT4 mRNA表达为对照组的58.7%(P＜0.05);10-8mol/L胰岛素组、10-6mol/L胰岛素组分别为对照组的230.2%和297.2%(P＜0.01);高糖加10-6mol/L胰岛素组,高糖加10-9mol/L胰岛素组分别为高糖组的170.6%和140.3%(P＜0.05).(3)高糖组F-actin荧光强度为对照组的44.5%;10-8mmol/L胰岛素组、10-6mol/L胰岛素组分别为对照组的122.4%(P＜0.05)和129.6%(P＜0.01);高糖加10-6mol/L胰岛素组为高糖组的183.8%(P＜0.05).(4)GluT4 mRNA表达与F-actin荧光强度呈正相关(r=0.786,P＜0.05).结论(1)正常系膜细胞有GluT4 mRNA表达.(2)高糖可抑制GluT4 mRNA表达及促进F-actin解聚.(3)胰岛素有一定拮抗作用,且呈剂量依赖性.(4)GluT4 mRNA表达与F-actin荧光强度呈正相关.(5)GluT4、F-actin是糖尿病肾病发生发展过程中的重要因子.
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肌球蛋白轻链激酶在烧伤大鼠血清引起的内皮细胞骨架改变过程中的作用
目的观察烧伤大鼠血清刺激人脐静脉内皮细胞株ECV-304引起的纤维状肌动蛋白在细胞内分布变化的时间效应以及肌球蛋白轻链激酶在其中的作用.方法用烧伤大鼠血清分别孵育细胞30min、1 h、2h、4h和6h.或在烧伤血清作用30 min之前或之后使用5μmol/L的ML-7作用30 min.使用罗丹明标记的鬼笔环肽探针特异性结合并显示细胞内的纤维状肌动蛋白,并在NikonTE-300荧光显微镜下观察照相.结果正常情况下,纤维状肌动蛋白主要分布在内皮细胞内的外周膜部位.使用烧伤大鼠血清进行30min～12 h的刺激后,内皮细胞内可观察到明显的应力纤维形成,并且随着刺激时间的延长而增强.可以通过使用肌球蛋白轻链激酶特异性抑制剂ML-7预处理细胞30min来抑制这种效应.此外,ML-7还能够改善烧伤大鼠血清引起的内皮细胞内肌动蛋白重排.结论本研究表明,大鼠烧伤血清能够通过激活肌球蛋白轻链激酶引起明显的细胞内肌动蛋白排列的改变.在烧伤血清刺激细胞后,抑制肌球蛋白轻链激酶可以改善烧伤大鼠血清引起的内皮细胞骨架重排.
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芦荟大黄素对肺癌A549细胞生长、迁移及F-actin的作用
目的:探讨芦荟大黄素对肺癌A549细胞生长、迁移及F-actin的影响.方法:将肺癌A549细胞分为对照组、芦荟大黄素低剂量组(10 μmol/L)、中剂量组(30 μmol/L)和高剂量组(50 μmol/L).采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Transwell小室检测细胞迁移能力,高内涵细胞成像系统分析芦荟大黄素对肺癌细胞骨架蛋白F-actin表达的影响,westem blotting检测各组细胞小窝蛋白-1 (Caveolin-1)、磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)、p65的表达.结果:与对照组相比,芦荟大黄素低剂量组细胞增殖抑制率、迁移能力、细胞骨架蛋白的面积未见明显变化(P＞0.05),而中、高剂量组细胞增殖抑制率增加、迁移能力降低,细骨胞架蛋白面积缩小,差异均有统计学意义(均P＜0.05).与对照组相比,低剂量组细胞中Caveolin-1、p-eNOS、p65蛋白的相对表达量并无明显变化(P＞0.05):中、高剂量组细胞Caveolin-1、p65表达增多,p-eNOS表达减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:芦荟大黄素能够抑制肺癌A549细胞的生长和迁移,其机制可能与影响Caveolin-1/eNOS/p65信号通路,增加F-actin的解聚、减少微丝的形成有关.
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PTEN过表达及其突变对活化肝星状细胞纤维状肌动蛋白的影响
目的 探讨过表达野生型第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)及其突变体G129E(仅保留蛋白磷酸酶活性而丧失脂质磷酸酶活性)对体外培养的活化肝星状细胞(HSC)纤维状肌动蛋白(F-actin)的影响. 方法 体外培养活化大鼠肝星状细胞(HSC-T6),用瞬时转染技术,将携带野生型PTEN基因及G129E基因的腺病毒转染活化HSC.实验分组如下:对照组:腺病毒转染时以DMEM培养基代替病毒液;Ad-GFP组:转染表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体空病毒Ad-GFP;Ad-PTEN组:转染携带野生型PTEN基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-PTEN;Ad-G129E组:转染携带G129E基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-G129E.应用Western blot及实时荧光定量PCR技术检测活化HSC的PTEN蛋白及mRNA表达;借助激光扫描共聚焦显微镜(LSCM),应用荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的鬼笔环肽检测HSC形态、F-actin的分布及荧光强度、伪足以及应力纤维的变化,并采用钙荧光探针Rhod-2/AM负载检测HSC内钙离子(Ca2+)浓度的变化.多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验. 结果 野生型PTEN基因及G129E基因在活化大鼠HSC大量表达;对照组与Ad-GFP组HSC多呈星形或多边体形,F-actin重构形成大量粗大的应力纤维,横跨于整个细胞内,细胞周围可见层状伪足;Ad-PTEN组及Ad-G 129E组HSC多为梭形,F-actin主要分布于细胞周边,细胞内可见少量纤细的应力纤维,细胞周边层状伪足消失.F-actin的荧光强度:Ad-PTEN组(357.67±13.39)及Ad-G129E组(377.25±14.55)较对照组(961.87±27.33)及Ad-GFP组(954.68±20.71)明显降低(F=1 783.486,P＜0.05);而Ad-PTEN组与Ad-G129E组、对照组与Ad-GFP组间的差异均无统计学意义(P＞ 0.05).HSC内Ca2+相对浓度:Ad-PTEN组(251.60±90.88)及Ad-G129E组(352.18±146.01)较对照组(1 953.95±132.99)及Ad-GFP组(1 937.57±115.17)明显降低(F=834.988,P＜0.05);而Ad-PTEN组与Ad-G129E组、对照组与Ad-GFP组间的差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 过表达的野生型PTEN及其突变体G129E可显著抑制体外活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的形成及细胞骨架的重构、降低了HSC内Ca2+浓度;并且,野生型PTEN的作用与其突变体G129E无明显差异.
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肾小球系膜细胞在高糖、胰岛素作用下F-actin的变化
目的:探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞骨架蛋白F-actin的影响,进一步探讨F-actin在糖尿病肾病发生发展中的作用.方法:将培养的鼠1097系膜细胞分为8组:正常对照组,生理浓度胰岛素组(10-9M),低浓度胰岛素组(10-8M),高浓度胰岛素组(10-6M),高糖组(30mM),甘露醇组,高糖加高浓度胰岛素组,高糖加生理浓度胰岛素组.采用rhodamine-phalloidin染色,激光共聚焦显微镜观察F-actin形态并测定荧光强度.结果:高糖组F-actin荧光强度为对照组的44.5%;10-8M胰岛素组、10-6M胰岛素组分别为对照组的122.4%(P＜0.05)和129.6%(P＜0.01);高糖加10-6M胰岛素组为高糖组的183.8%(P＜0.05).结论:(1)高糖可促进F-actin解聚,胰岛素有一定拮抗作用,且呈剂量依赖性.(2)F-actin是糖尿病肾病发生发展中的重要因子.
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C型凝集素9家族A成员的研究进展
C型凝集素9家族A成员(CLEC9A),又称为树突状细胞-NK细胞凝集素群受体1(DNGR-1),属于非经典的2型跨膜C型凝集素样受体,其表达具有高度的树突状细胞(DC)限制性.小鼠CLEC9A主要表达在CD8α+DC和CD103+ DC表面,人CLEC9A主要表达在血液树突状细胞抗原3阳性DC(BDCA3+DC)表面.在表型和功能方面,人的同时表达CLEC9A和BDCA3(CLEC9A+ BDCA3+)的DC与小鼠的CD8α+DC具有相似性.CLEC9A能够与坏死或受损细胞的纤维状肌动蛋白结合,经细胞质区的免疫受体酪氨酸活化基序结构启动细胞内信号的转导.CLEC9A能介导内吞作用,参与交叉提呈抗原等作用,在抗病毒感染、肿瘤预防与治疗和疫苗的研究中具有潜在的应用前景.本文阐述了CLEC9A分子的研究进展.
