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zdhhc17对斑马鱼集中延伸运动的调节及其机制
目的 通过抑制zdhhc17基因的表达,探讨其在斑马鱼胚胎发育过程中的作用及机制.方法 通过显微注射zdhhc17吗啉反义寡聚核苷酸(MO)抑制zdhhc17翻译,观察斑马鱼胚胎发育过程中相关表型的变化.利用斑马鱼整封原位杂交技术,检测集中延伸运动相关标记基因(dlx3b、ntl、myod1、tbx6等)的表达变化.利用RT-PCR技术,检测集中延伸运动相关调控因子mRNA表达水平的变化.结果 敲除zdhhc17基因后,斑马鱼胚胎集中延伸运动出现严重缺陷,主要表现为尾部弯曲变短(82/118),且集中延伸运动相关标记基因表达异常,钙黏附蛋白家族cdhi、padh18a mRNA水平降低.结论 zdhhc17通过调节钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a基因的表达,进而影响细胞黏附运动,终参与调控斑马鱼胚胎集中延伸运动.
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流感病毒蛋白棕榈酰化修饰的研究进展
脂类修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,流感病毒蛋白可发生不同类型的脂酰化修饰,其中棕榈酰化修饰是其脂类修饰的主要形式,棕榈酰化修饰对流感病毒蛋白的运输、疏水性、胞内定位等具有重要意义,同时在流感病毒装配、膜融合时发挥重要作用.目前,对蛋白棕榈酰化修饰的研究方法主要有放射性同位素标记法、酰基-生物素置换法(acyl-biotinyl exchange,ABE)、质谱检测法.本文对流感病毒蛋白棕榈酰化修饰的研究进展及其分析方法作一综述,为进一步了解流感病毒蛋白棕榈酰化的机制提供参考.
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AMPA受体棕榈酰化在亚慢性铝染毒大鼠海马长时程增强中的作用
[目的]研究α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体棕榈酰化修饰在亚慢性铝染毒在大鼠海马长时程增强(LTP)中的作用.[方法]健康成年雄性SD大鼠24只,按体重相近者随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组6只,采用腹腔注射麦芽酚铝的方式对大鼠进行染毒,对照组给予生理盐水,低、中、高剂量组的铝染毒剂量分别为10、20、40μmol/kg,隔天染毒,共染毒12周.染毒结束后采用在体海马CA1区LTP记录技术,记录兴奋性突触后电位,然后断头取海马,采用酰基生物素置换法测定AMPA受体棕榈酰化水平.[结果] LTP检测结果显示,高频刺激后1min和60 min时,各剂量组的标准化幅值(后简称“幅值”)差异有统计学意义(P＜0.05);30min时差异无统计学意义.1min时,中、高剂量组的幅值低于对照组和低剂量组,差异均有统计学意义(P＜0.05).60 min时,低、中、高剂量组的幅值均低于对照组,且高剂量组的幅值低于低、中剂量组,差异均有统计学意义(P＜0.05).酰基生物素置换法结果显示,中、高剂量组的离子型谷氨酸受体1(GluR1)低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);中剂量组的离子型谷氨酸受体2(GluR2)棕榈酰化水平低于对照组,高剂量组的GluR2棕榈酰化水平低于对照组及低、中剂量组,差异均有统计学意义(P＜0.05).[结论]亚慢性铝染毒后,大鼠海马LTP受到抑制,AMPA受体棕榈酰化水平降低,这提示AMPA受体棕榈酰化降低可能是LTP损害的机制之一.
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病毒蛋白脂酰化及其功能
脂酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰，主要包括棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊烯化和糖基化磷脂酰肌醇（GPI）共价结合4种方式。不同的病毒蛋白可发生不同类型的脂酰化，其生物学功能也会发生相应改变。棕榈酰化通常能增强病毒跨膜蛋白的疏水性，调节这些蛋白的胞内运输及定位，进一步影响病毒感染过程中的膜融合、病毒颗粒装配及释放等步骤。豆蔻酰化则可调控病毒蛋白表面的正电荷强度，使病毒蛋白与脂质膜的亲和力改变，如preS1豆蔻酰化加强乙型肝炎病毒（HBV）和丁型肝炎病毒（HDV）的受体识别能力及感染性，而人类免疫缺陷病毒（HIV）Nef豆蔻酰化为病毒感染及免疫应答所必需。异戊烯化能使病毒游离的蛋白与膜结合，并介导蛋白间的相互作用，如大 HDV抗原（L-HDAg）异戊烯化有利于其运输至内质网膜上，与HBV表面抗原（HBsAg）及HDV RNA共同形成HDV颗粒。此外，一些病毒蛋白与GPI通过共价结合形成复合物，GPI基团可改变感染细胞的膜结构及胞质内磷脂构成，如GPI与朊蛋白（PrP）结合导致细胞型朊蛋白（PrPc ）交联或羊痒疫朊蛋白（PrPsc ）聚集，与朊病毒引起的海绵样病变有关。进一步了解病毒蛋白脂酰化机制，有利于设计和开发以此为靶点的特异性抗病毒新药。
关键词： 病毒蛋白 棕榈酰化 豆蔻酰化 异戊烯化 糖基化磷脂酰肌醇共价结合 -
利拉鲁肽的制备
以Fmoc-氨基酸为原料,Fmoc-Gly-Wang树脂为载体,按照氨基酸序列从C端到N端进行依次耦合得Arg34GLP-1 (7-37),经由谷氨酸介导的肽链棕榈酰化,制备得利拉鲁肽.经RP-HPLC纯化得到纯度为95％以上的样品,总收率为12.8％.
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小鼠精子热休克蛋白90的棕榈酰化
蛋白质棕榈酰化是指饱和十六碳的棕榈酸盐通过硫酯键或者酰胺键连接在蛋白质肽链的半胱氨酸上,属翻译后修饰,可影响蛋白质的相互作用、稳定性及定位等功能.热休克蛋白90 (heat shock protein 90,Hsp90)是一种重要的分子伴侣,已证明其参与精子获能等生理过程.然而,哺乳动物精子中是否存在蛋白质棕榈酰化,Hsp90在精子不同生理状态下是否发生棕榈酰化,目前尚不清楚.本研究首先采用酰基-生物素置换法检测小鼠附睾尾部成熟精子总蛋白质棕榈酰化情况,然后通过CSS-Palm 4.0软件预测Hsp90的棕榈酰化位点,再进一步结合免疫沉淀方法检测附睾头部、附睾尾部精子的Hsp90棕榈酰化情况.结果显示,小鼠附睾尾部精子多种蛋白质存在棕榈酰化,其中分子量大小约50、65、72、85和130 kDa的蛋白质发生棕榈酰化为显著;软件预测显示Hsp90两个亚型共有5个棕榈酰化位点;免疫沉淀结果也显示小鼠精子存在棕榈酰化的Hsp90,且其棕榈酰化水平与小鼠精子的生理状态有关:附睾尾部棕榈酰化水平比附睾头部高,而获能后的棕榈酰化水平比获能前明显升高.以上结果表明,哺乳动物精子中存在蛋白棕榈酰化,且Hsp90棕榈酰化可能参与精子生理状态的调节.
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H2O2对SD大鼠海马AMPA受体棕榈酰化水平的影响
目的 研究H2O2对SD大鼠海马α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异(噁)唑丙酸(AMPA)受体棕榈酰化水平的影响.方法 用400μMH2O2孵育正常大鼠急性脑片后,分离海马组织;酰基生物素交换技术提取AMPA受体亚基GluA1、GluA2棕榈酰化蛋白;蛋白免疫印迹技术检测上述蛋白表达水平.结果 与对照组相比,H2O2升高大鼠海马蛋白棕桐酰化总水平、GluA1(P＜ 0.05)和GluA2(P＜0.01)棕榈酰化水平.结论 400μMH2O2可显著提高SD大鼠海马AMPA受体棕榈酰化水平.
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LAT棕榈酰化在裸鼠T系白血病细胞信号转导中的作用
目的 建立人Jurkat淋巴细胞白血病裸鼠模型,观察Jurkat细胞在小鼠体内存活及增殖情况,研究T细胞活化连接蛋白(LAT)及其棕榈酰化在T细胞活化信号转导中的相关作用.方法 将Balb/c纯系雌性裸鼠随机分为正常Jurkat组、正常LAT转染组、突变LAT转染组以及空白对照组,每组6只.连续2d腹腔定量注射环磷酰胺后,实验组小鼠尾静脉注射人Jurkat细胞株5×106/只,对照组小鼠尾静脉注射等量PBS溶液.观察小鼠发病一般体征、体质量及外周血白细胞数量变化,濒死小鼠处死后取病理组织进行HE染色观察.流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞阳性率.结果 接种肿瘤细胞后,实验组小鼠逐渐出现体质量减轻、弓背、精神萎靡等症状,外周血WBC计数逐渐增高,生存时间缩短.骨髓及肝脾组织可见肿瘤细胞浸润.流式细胞仪检测结果显示,正常LAT转染组肿瘤细胞阳性率高于其他各组.结论 成功建立人Jurkat细胞裸鼠动物模型,从体内实验进一步证实LAT棕榈酰化促进T细胞活化增殖,而LAT棕榈酰化位点突变后,将阻碍T细胞活化信号的传递.
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T细胞活化接头蛋白棕榈酰化位点突变抑制CD59 GPI介导的T淋巴细胞活化信号转导
目的 构建T细胞活化接头蛋白(LAT)棕榈酰化位点突变的慢病毒,感染Jurkat细胞,建立稳定转染的细胞株,观察LAT棕榈酰化位点突变对CD59介导的T淋巴细胞活化信号转导的影响.方法 构建阴性对照(neg-EGFP)、LAT-M-EGFP融合蛋白基因载体,包装成慢病毒,分别感染Jurkat细胞,建立稳定感染的细胞株.激光共聚焦显微镜观察病毒感染效率及融合蛋白在细胞上的定位;CCK-8法检测CD59单克隆抗体交联前后各组细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Westernblot法检测磷脂酶Cγ1(PLC-γ1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)蛋白的表达.结果 共聚焦显微镜观察发现LAT-M组细胞的LAT分子在细胞膜上散在分布,CD59抗体交联刺激后,未出现明显的点簇状聚集区.与阴性对照细胞相比,LAT-M细胞增殖活性明显降低,中晚期凋亡细胞明显增加;Western blot结果显示,LAT-M组的PLC-γ1、LCK蛋白表达水平和阴性对照组大致相同,经抗体活化后无明显变化,而阴性对照细胞的PLC-γ1、LCK蛋白表达量下降.结论 LAT棕榈酰化位点突变的Jurkat细胞脂筏定位功能缺失,细胞处于抑制状态,对CD59糖基磷脂酰肌醇(GPI)介导的T淋巴细胞活化信号转导有抑制作用.
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T细胞活化连接蛋白脂筏定位功能缺失影响T细胞内CD59信号转导的功能
目的 用前期构建好的T细胞活化连接蛋白(LAT)-EGFP质粒,基因点突变技术使LAT-EGFP的棕榈酰化位点突变,使LAT-EGFP-M(棕榈酰化位点突变的LAT-EGFP)的细胞膜定位功能缺失,抗体交联CD59后观察T细胞信号活化状态的改变.方法 采用电转染的方法转染Jurkat细胞,抗体交联CD59后,共聚焦荧光显微镜下观察LAT分布情况的变化；用噻唑蓝(MTT)比色法检测抗体交联前后各组Jurkat细胞增殖情况差别；应用ELISA检测各组细胞上清中IL-2的变化水平；用Westernblot技术检测抗体交联后LAT-EGFP和LAT-EGFP-M的磷酸化程度.结果 抗体交联CD59之后,LAT-EGFP-M较LAT-EGFP相比不能定位聚集于CD59所在的脂筏区域,并且转染了突变LAT-EGFP-M质粒的Jurkat细胞增殖速度和IL-2分泌能力低于转染LAT-EGFP质粒、转染空载体EGFP-N3及未转染的细胞.LAT-EGFP-M的磷酸化程度远低于LAT-EGFP.结论 棕榈酰化位点缺失的LAT会减弱CD59在T细胞中的信号转导功能.
