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血根碱抑制TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞向间质细胞转化研究
目的：研究血根碱（SAN）对TGF?β1诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）向间质细胞转化的影响，并探讨其发生机制。方法使用TGF?β1（10μg/L）刺激HUVEC，观察不同浓度SAN对TGF?β1诱导HUVEC向间质细胞转化的影响。采用CCK8检测不同浓度SAN对HUVEC细胞活性的影响；在倒置相差显微镜下观察HUVEC形态学的改变；采用实时半定量逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）检测细胞中collagen?1，fibronectin，N?cadherin的基因表达水平；免疫印迹法检测细胞中p?Smad2，Smad2，p?Smad3，Smad3的蛋白表达量。结果 CCK8结果显示：不同浓度SAN干预HUVEC 72 h后，细胞活性无明显改变；光学显微镜下观察到HUVEC在正常情况下呈规则的铺路石样生长，TGF?β1作用于细胞后可见细胞形态向长梭形转变，而当SAN（0.25μmol/L）与TGF?β1同时作用时则可显著逆转这一现象；RT?PCR结果显示TGF?β1可显著上调HUVEC胞内collagen?1，fibronectin，N?cadherin的基因表达水平，当SAN与TGF?β1同时作用时，可明显逆转这种现象；WB结果显示，在TGF?β1的作用下，p?Smad2和p?Smad3表达增加，而当SAN与TGF?β1同时作用时可逆转这一现象。结论 SAN可抑制TGF?β1诱导的HUVEC向间质细胞转化，提示其对于治疗心肌纤维化疾病可能具有重要的作用。
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高盐喂食对Dahl盐敏感大鼠肾小管上皮向间质转化和肾脏纤维化的影响
目的 探讨高盐喂食对Dahl盐敏感大鼠肾小管上皮向间质转化(EMT)和肾脏纤维化的影响.方法 7～8周龄雄性Dahl盐敏感大鼠(SS,n=24)及SS-13BN大鼠(13BN,n=12),高盐(8％ NaCl)、低盐(0.3％ NaCl)喂食干预4周与8周,测量血压、血尿生化指标;采用Masson染色评估肾脏纤维化程度;免疫组化和实时定量聚合酶链反应(PCR)分别检测肾小管上皮标志E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间质细胞标志α平滑肌肌动蛋白(α-SMA) mRNA和蛋白的表达情况.结果 ①与基线期比较,SS和13BN大鼠高盐干预4周后收缩压增高,SS大鼠增高幅度更为明显[SS:(184.4±4.5)比(139.0±0.3)mm Hg;13BN:(156.3±2.1)比(139.8±1.2)mm Hg];8周高盐干预时血压显著高于4周[(227.1±3.6)比(184.4±4.5)mm Hg,P＜0.01].②4周高盐负荷后,两种大鼠肾脏出现明显的胶原纤维沉积,且SS高盐组明显多于13BN高盐组[肾小球:(9.8±1.9)％比(8.7±0.4)％;肾间质:(9.1±0.2)％比(6.7±0.3)％].8周时,SS高盐组肾小球和间质胶原沉积较4周进一步加重[肾小球:(15.4±0.9)％比(9.8±1.9)％;肾间质:(13.9±0.4)％比(9.1±0.2)％].③4周和8周高盐干预后,与SS低盐组相比,SS高盐组肾脏E-cadherin表达均减少,α-SMA表达增加.④肾脏纤维化程度与肾小管EMT的发生相关(E-cadherin:r=-0.720,α-SMA:r=0.848;均P＜0.01).结论 高盐喂食可诱导Dahl盐敏感大鼠肾小管上皮细胞EMT的发生,促进肾脏纤维化.
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JDP2在TGF-β1诱导的人胰腺癌细胞系Panc-1上皮向间质转化中的作用
目的:研究JDP2与TGF-p1诱导的人胰腺癌细胞系P anc -1上皮向间质转化之间的关系.方法:实验分为空白对照组、JDP2转染组、空质粒转染组3组,并分别用P、P-J-T、P-V-T缩写代表.用pCEFL-HA-JDP2质粒和pCEFL空质粒瞬时转染人胰腺癌细胞系Panc-1,48 h之后应用TGF-p1分别刺激JDP2转染和空质粒转染组细胞48 h.以正常的Panc-1细胞为空白对照组,仅加等量的PSB.倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化的差异;应用RT-PCR及Western blot的方法检测E-cadherin及vimentin的蛋白及mRNA表达变化；应用Transwell侵袭实验观察各组细胞的迁移能力.结果:P-J-T组能够明显抑制由TGF-β1诱导产生的EMT.与P组相比,P-J-T组大部分细胞没有明确的形态学上的变化,E-cadherin及vimentin蛋白及mRNA表达变化不明显,迁移能力亦无明确差异(48.0±5.3 vs 52.0±7.2),未成功诱导EMT;而P-V-T组Panc-1细胞大多数变成长梭形,细胞间紧密连接丢失,E-cadherin表达明显降低(mRNA表达:P＜0.01;蛋白表达:P＜0.05),vimentin蛋白及mRNA表达明显升高(P＜0.01),侵袭至小室下室的细胞明显增加(48.0±5.3 vs 81.0±10.7,P＜0.01),出现非常显著的上皮向间质转化特征.结论:JDP2具有明显抑制EMT的作用,JDP2转染后的胰腺癌细胞系可以明显抑制由TGF-β1诱导的EMT,这使得JDP2有可能成为新的胰腺癌的靶向治疗因子.
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基因沉默整合素连接酶对胰腺癌细胞上皮向间质转化的影响
目的：探讨基因沉默整合素连接酶(ILK)对胰腺癌细胞(Panc-1)上皮向间质转化(EMT)的影响。方法培养 Panc-1细胞,构建 ILK-specific-shRNA 慢病毒载体后,再行转染 Panc-1细胞,通过Western-blot 技术验证感染基因的有效性,同时比较 Panc-1细胞上皮向 EMT 转化标志性蛋白 E-钙连蛋白(E-cadherin)表达情况。结果①基因沉默 ILK 明显的抑制了 Panc-1细胞的迁移、侵袭能力,且阳性组细胞迁移率和侵袭率均为(0.15±0.03),明显低于阴性组(0.43±0.02),差异具有统计学意义(t=23.572, P<0.01)。② SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉法(SDS-PAGE)结果：E-cadherin 的条带为122~141 KD, GAPDH为37 KD 的条带。siRNA 慢病毒转染 Panc-1细胞后 KD 组 E-cadherin 表达为(0.545±0.011),明显高于阴性组(0.079±0.004),差异有统计学意义(t=28.942, P<0.01)。结论基因沉默 ILK 转染后,明显抑制 Panc-1细胞迁移、侵袭能力,显著上调 E-cadherin 表达,逆转了 EMT 的发生。
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新基因JDP2通过不同通路抑制人胰腺癌上皮向间质转化作用的研究
目的 研究Jun二聚化蛋白2(JDP2)与人胰腺癌细胞系BxPC3上皮向间质转化(EMT)之间的关系.方法 应用pCEFL-HA-JDP2质粒瞬时转染BxPC3细胞系,并继续分别用转化生长因子β1(TGF-β1)和Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)诱导,以仅加DMSO为空白对照组,倒置显微镜观察细胞形态学变化,Western blot及免疫荧光检测E-cadherin、vimentin的表达.Transwell小室侵袭实验验证侵袭能力的变化.结果 与空白对照组相比,转染JDP2组上皮标志物E-cadherin及间质标志物vimentin表达变化不明显,而转染空质粒组则E-cadherin表达降低而vimentin表达升高,提示JDP2能够抑制由Collagen Ⅰ及TGF-β1诱导的EMT;同时我们验证,转染JDP2质粒组细胞侵袭能力亦明显小于转染空质粒组细胞(P＜0.05).结论 JDP2,作为AP-1类因子的抑制因子,可以通过不同通路抑制EMT的产生,从而为胰腺癌的分子靶向治疗找到新的方向.
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微小RNA在叉头转录因子M1激活非小细胞肺癌上皮向间质转化中的作用
目的：探讨微小RNA（microRNA）在叉头转录因子M1（Fox M1）激活非小细胞肺癌（non‐small cell lung cancer ， NSCLC）细胞上皮向间质转化（epithelial‐mesenehymal transition ，EMT）中的作用。方法：将 Fox M1过表达质粒，Fox M1‐shRNA ，miR‐539、miR‐485‐5p模拟物及其抑制物转染至人 NSCLC细胞株中，应用Western印迹和real‐time PCR检测细胞株中Fox M1蛋白和mRNA及miR‐539、miR‐485‐5p的表达。同时应用CCK‐8和细胞迁移实验观察 Fox M1、miR‐539和 miR‐485‐5p对NSCLC细胞的增殖和侵袭功能的影响。应用荧光素酶报告基因实验检测miR‐539和miR‐485‐5p与EM T调控蛋白ZEB1和Snail1的关系。结果：Fox M1过表达下调NSCLC细胞中miR‐539、miR‐485‐5p ，转染Fox M1‐shRNA后NSCLC细胞中miR‐539、miR‐485‐5p升高。MiR‐539和miR‐485‐5p抑制Fox M1对NSCLC细胞增殖和侵袭的促进作用。NSCLC细胞中miR‐539对EM T调控蛋白ZEB1，miR‐485‐5p对EM T调控蛋白Snail1的表达有抑制作用。结论：miR‐539和miR‐485‐5p能抑制NSCLC细胞中Fox M1‐EM T通路，从而影响NSCLC细胞的增殖和侵袭，抑制NSCLC的远处转移。
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炎性反应微环境对结肠癌细胞上皮向间质转化的作用
目的 探讨炎性反应微环境中TNF-α和TGF-β1对结肠癌细胞上皮向间质转化的作用.方法 以10 μg/L TGF-β1或20 μg/L TNF-α或两者混合后分别作用于人结肠癌细胞系SW480细胞、HCT116细胞和经转化生长因子β受体2(TGFBR2)干扰的SW480细胞,单纯SW480细胞和HCT116细胞分别设为空白对照,分别于作用24、48和72 h观察各组细胞形态变化.采用实时定量RT-PCR和Western印迹法检测各组上皮钙黏素、神经钙黏素和波形蛋白的表达变化.通过细胞迁移实验检测TGFBR2干扰后细胞迁移能力的变化.采用单因素方差分析进行统计学处理.结果 不同时间点,TGF-β1和TNF-α分别作用于SW480细胞、HCT116细胞和经TGFBR2干扰的SW480细胞,其细胞形态均未发生明显的变化;TGF-β1和TNF-α混合作用于以上3组细胞,其中SW480细胞和经TGFBR2干扰的SW480细胞向成纤维细胞样形态变化.与TGF-β1和TNF-α混合作用的SW480组以及SW480空白组相比,经TGFBR2干扰的SW480组中上皮钙黏素mRNA表达(0.58±0.23比0.80±0.12比0.23±0.03)明显下调,神经钙黏素mRNA表达(1.10±0.10比0.60±0.11比1.34±0.20)显著升高,差异均有统计学意义(F=46.92、47.93,P均＜0.05),而波形蛋白mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).TGF-β1和TNF-α混合作用的HCT116组与HCT116空白组相比,上皮钙黏素mRNA表达(0.22±0.03比0.92±0.14)明显下调,神经钙黏素(1.40±0.05比0.46±0.02)和波形蛋白(1.60±0.12比0.78±0.11)的mRNA表达均显著升高,差异均有统计学意义(F=72.59、23.67、45.19,P均＜0.05).各组上皮钙黏素、神经钙黏素和波形蛋白的蛋白表达与mRNA表达一致.经TGFBR2干扰的SW480组A570为102.7±8.5,TGF-β1和TNF-α混合作用的SW480组和SW480空白组分别为20.1±7.6、18.3±11.2,差异有统计学意义(F=108.92,P＜0.05).提示TGF-β1和TNF-α共同作用于TGFBR2突变的细胞后,细胞迁移能力明显增强.结论 炎性反应微环境中富集TNF-α和TGF-β1时,可能有利于结肠癌细胞的早期转移,尤其对于TGFBR2突变的结肠癌细胞.
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转化生长因子β对A431细胞上皮向间质转换相关分子表达的影响
目的 研究转化生长因子β(TGF-β)对人表皮鳞状细胞癌A431细胞上皮向间质转换(EMT)相关分子表达的影响.方法 用含7.5 μg/L TGF-β处理A431细胞72 h后观察细胞形态,采用实时定量PCR和Western印迹分别在mRNA水平和蛋白水平检测EMT相关基因E钙黏着蛋白、N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达水平的变化.未经TGF-β处理的A431细胞为对照组.结果 TGF-β处理后,A431细胞独立分散,呈梭形.实时定量PCR结果显示,E钙黏着蛋白表达量为未经TGF-β处理组的31.7％,N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达量分别为未经处理组的2.475、11.340、2.615倍;Western印迹结果,N钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达量上升,E钙黏着蛋白表达量下降.结论 TGF-β可诱导A431细胞产生EMT现象,TGF-β表达量上升,可能参与表皮鳞状细胞癌发生侵袭、转移.
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基因沉默整合素连接酶对胰腺癌细胞上皮向间质转化的影响
目的 研究基因沉默整合素连接酶(ILK)对胰腺癌细胞(Panc-1)上皮向间质转化(EMT)的影响.方法 对胰腺癌Panc-1细胞进行细胞培养,成功构建ILK-specific shRNA慢病毒载体后对Panc-1细胞进行转染,荧光显微镜下观察,评估转染效率,然后通过Q-PCR及Western blot方法验证干扰基因片段的有效性,应用Transwell方法比较转染前后各组胰腺癌细胞迁移、侵袭能力,再通过WB比较各组胰腺癌细胞上皮向间质转化(EMT)标志性蛋白E-cadherin表达情况.结果 siRNA-ILK慢病毒载体构建完成后对Panc-1细胞转染,通过荧光显微镜下观察可见感染效率达80％以上,RNAi靶点病毒感染的细胞组(KD)的ILK mRNA及蛋白表达明显低于空病毒组(NC)及正常细胞组(CON) (P＜0.01).siRNA慢病毒转染对Panc-1细胞迁移、侵袭实验结果显示基因沉默ILK后胰腺癌细胞的迁移能力、侵袭能力受到了明显的抑制,迁移侵袭的细胞数减少.其中KD组的迁移率比较NC组,具有明显的差异(P＜0.01),而KD组的侵袭率比较NC组也有显著的差异(P＜0.05)以NC组为阴性对照,以GAPDH为内参,采用Western blot检测NC、KD组细胞的E-cadherin蛋白表达情况.S实验结果表明siRNA慢病毒转染Panc-1细胞后KD组E-cadherin表达较NC组明显上调(P＜0.01).结论 基因沉默ILK的胰腺癌细胞(Panc-1)后,其迁移、侵袭能力受到明显的抑制,EMT标志性蛋白E-cadherin表达也明显上调,逆转了EMT的发生.
