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血根碱通过调控PI3K/Akt信号通路诱导胰腺癌细胞凋亡的机制
目的:探讨血根碱对胰腺癌细胞凋亡的影响及其信号通路调控机制.方法:不同浓度血根碱(2,4,6 μmol·L-)处理小鼠胰腺癌Panc02细胞不同时间(24,48,72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测血根碱对细胞生长抑制作用的影响;采用磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染色试剂盒通过流式细胞仪检测血根碱对Panc02细胞凋亡影响;采用花青染料(JC-1)探针试剂盒荧光染料分析检测线粒体膜电位的变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),总蛋白激酶B(Akt),磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),总磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)的表达情况.结果:与空白组比较,不同浓度的血根碱作用同一时间后,随着药物浓度的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P＜0.05),与空白组比较,同一浓度作用不同时间后,随着时间的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P＜0.05);与空白组比较,血根碱2 μmol·L-组的细胞凋亡率无明显升高,与空白组比较,血根碱4,6μmol·L-组的细胞凋亡率均明显升高(P＜0.05);与空白组比较,血根碱2 μmol· L-1组时红绿荧光无变化,血根碱4,6 μmol·L-组红色荧光减弱,绿色荧光增强,Panc02细胞线粒体膜电位降低;与空白组比较,血根碱2μmol· L-组处理的Bax,Bcl-2,p-PI3K,p-Akt,Akt和PI3K蛋白表达均无变化,血根碱6 μmol·L-组Bax蛋白表达增高,Bcl-2及PI3 K/Akt信号通路中关键蛋白p-PI3K,p-Akt表达降低(P＜0.05).结论:血根碱通过抑制PI3 K/Akt信号通路有效地诱导小鼠胰腺癌Panc02细胞经线粒体凋亡途径发生凋亡.
关键词： 胰腺癌 血根碱 细胞凋亡 Panc02细胞 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路 -
高效毛细管电泳测定小果博落回中血根碱和白屈菜红碱
目的:建立测定小果博落回中血根碱和白屈菜红碱的含量的新方法.方法:采用高效毛细管电泳法,盐酸小檗碱为内标,运行缓冲液为25 mmol·L-1磷酸氢二钠与25 mmol·L-1磷酸二氢钠的混合体系(磷酸调pH为7.0)-甲醇(2.5:1);运行电压18 kV;柱温25℃;检测波长200nm.结果:血根碱和白屈菜红碱的线性范围分别为0.0124～0.0828mg·mL-1(r=0.999 8);白屈菜红碱的线性范围0.018 8～0.125 6 mg·mL-1(r=0.999 6),平均加样回收率(n=6)分别为98.7%(RSD1.01%)、98.4%(RSD 1.27%).结论:高效毛细管电泳操作简便,分析快速,结果准确、重现性好,适用于小果博落回中血根碱和白屈菜红碱的含量的测定.
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白屈菜红碱、血根碱单体的分离和鉴定
目的:分离及鉴定白屈菜红碱和血根碱单体.方法:采用柱色谱分离技术对白屈菜红碱和血根碱进行分离纯化,通过HPLC进行鉴定.结果:采用柱色谱法可获得单一成分,经HPLC鉴定为白屈菜红碱和血根碱单体,纯度分别为98.6％,95.7％.结论:采用柱色谱技术可从博落回中提取、分离到高纯度的白屈菜红碱和血根碱单体.
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博落回内生真菌的分离及产血根碱菌株的筛选
采用组织块法从皖西大别山野生博落回Macleaya cordata中分离内生真菌,根据形态学特征对其进行类型归类,采用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)鉴定其内生真菌次级代谢产物,运用形态学方法对活性菌株进行初步菌种鉴定.实验结果显示,分别从博落回根、茎、叶中分离出28,57,96株内生真菌.根据形态学特征,初步把其归类为26个类型.其中菌株BLH 51的发酵液中含有血根碱,经形态学初步鉴定为层出镰刀菌Fusarium proliferatum.表明药用植物博落回组织中含有较丰富的内生真菌,可以成为寻找生物活性代谢产物的一个新来源.
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血根碱对紫杉醇耐药卵巢癌A2780/Taxol细胞生长及TGF-β1/Smad通路抑制的影响
目的 探讨血根碱对紫杉醇耐药卵巢癌A2780/Taxol细胞生长及TGF-β1/Smad通路和紫杉醇敏感性的影响.方法 将A2780/Taxol细胞分为对照组、血根碱组、紫杉醇组、血根碱联合紫杉醇组(简称联合组),对照组加生理盐水,其余3组分别应用2 μmol/L血根碱、2μg/mL紫杉醇,2μmol/L血根碱+2 μg/mL紫杉醇处理.48 h后应用倒置显微镜观察A2780/Taxol细胞形态、MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot法检测Caspase-3、TGF-β1、Smad7蛋白表达.结果 对照组细胞贴壁生长,边界清楚;血根碱组细胞体积缩小,贴壁数减少;紫杉醇组见细胞呈圆形脱落;联合组上过变化为明显.与对照组比较,3组均可显著抑制A2780/Taxol细胞增殖,上调Caspase-3、Smad7蛋白表达、下调TGF-β1蛋白表达,联合组作用为明显(P＜0.05).血根碱组对细胞周期无影响,紫杉醇组及联合组G0/G1期、S期细胞减少,G2/M期细胞增多.结论 血根碱通过抑制TGF-β1/Smad通路,促进Caspase-3表达抑制A2780/Taxol细胞生长,促进紫杉醇药物敏感性.
关键词： 血根碱 卵巢癌 紫杉醇 耐药 TGF-β1/Smad通路 -
血根碱抑制TGF-β1诱导人脐静脉内皮细胞向间质细胞转化研究
目的：研究血根碱（SAN）对TGF?β1诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）向间质细胞转化的影响，并探讨其发生机制。方法使用TGF?β1（10μg/L）刺激HUVEC，观察不同浓度SAN对TGF?β1诱导HUVEC向间质细胞转化的影响。采用CCK8检测不同浓度SAN对HUVEC细胞活性的影响；在倒置相差显微镜下观察HUVEC形态学的改变；采用实时半定量逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）检测细胞中collagen?1，fibronectin，N?cadherin的基因表达水平；免疫印迹法检测细胞中p?Smad2，Smad2，p?Smad3，Smad3的蛋白表达量。结果 CCK8结果显示：不同浓度SAN干预HUVEC 72 h后，细胞活性无明显改变；光学显微镜下观察到HUVEC在正常情况下呈规则的铺路石样生长，TGF?β1作用于细胞后可见细胞形态向长梭形转变，而当SAN（0.25μmol/L）与TGF?β1同时作用时则可显著逆转这一现象；RT?PCR结果显示TGF?β1可显著上调HUVEC胞内collagen?1，fibronectin，N?cadherin的基因表达水平，当SAN与TGF?β1同时作用时，可明显逆转这种现象；WB结果显示，在TGF?β1的作用下，p?Smad2和p?Smad3表达增加，而当SAN与TGF?β1同时作用时可逆转这一现象。结论 SAN可抑制TGF?β1诱导的HUVEC向间质细胞转化，提示其对于治疗心肌纤维化疾病可能具有重要的作用。
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血根碱对人脑胶质瘤A172细胞生长及放射敏感性的影响
目的 探讨血根碱对人脑胶质瘤A172细胞的生长及放射敏感性的影响.方法 采用MTT法检测血根碱处理后A172细胞的生长和增殖；细胞流式技术测定细胞周期改变以及活性氧(ROS)的变化；磷脂酰丝氨酸外翻分析法检测细胞凋亡；细胞克隆形成法观察血根碱和辐射的联合作用.结果 血根碱明显抑制脑胶质瘤A172细胞的生长,12、24和48 h血根碱处理导致细胞生长抑制的半数抑制浓度(IC50)分别为4.83、3.91和3.25 μmol/L.血根碱可以诱导剂量依赖性的细胞周期S期阻滞.与未处理的对照组相比,5 μmol/L血根碱处理A172细胞24 h后,早期凋亡细胞比例从(2.92±0.83)％增至(60.01±3.73)％,晚期凋亡细胞从(0.64±0.19)％增至(2.70±0.18)％,坏死细胞从(0.52±0.19)％增至(3.93±0.76)％,差异均具有统计学意义(t=55.28、8.32和9.51,P＜0.05).另外,血根碱可以诱导ROS的产生,5μmol/L血根碱处理后ROS水平是对照组的4.1倍,而抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸(NAC)能有效地抑制血根碱的细胞毒作用.采用多靶单击模型拟合曲线发现,与单纯照射组相比,血根碱预处理+照射的联合处理组的放射增敏比(SERD0)达1.48.结论 血根碱可以通过诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡和ROS的产生抑制脑胶质瘤A172细胞的生长,而且在低剂量下,血根碱预处理可增加放射敏感性.
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血根碱对卵巢癌细胞生长及放射敏感性的影响
目的 探讨血根碱对卵巢癌SK-OV-3细胞的生长及放射敏感性的影响.方法 采用MTT法和克隆形成法检测血根碱处理后卵巢癌SK-OV-3细胞的生长；流式细胞仪分析方法观察血根碱对细胞周期分布和细胞凋亡的影响；Annexin V/PI法观察血根碱联合辐照对细胞凋亡的影响.结果 0 ～5 μmol/L血根碱处理24和48 h后,细胞生长的抑制与血根碱处理的剂量和时间成正相关(r=0.96和0.97),半数细胞生长抑制的浓度(IC50)分别为3.02和1.11 μmol/L.血根碱处理导致了包括细胞变圆、皱缩,漂浮细胞增多等细胞形态学的改变.Sub-G1凋亡峰随血根碱浓度上升而增高,并出现G0/G1期细胞周期阻滞.0.5μmol/L血根碱预处理24 h后经6 Gy的X射线辐照,早期凋亡细胞从10.28％增加至43.28％(t=19.41,P＜0.01),晚期凋亡细胞从20.26％增加至30.80％(t=8.78,P＜0.01).采用多靶单击模型拟合曲线发现血根碱+X射线组与X射线单独照射组的放射增敏比(SERD0)达1.625,即低浓度的血根碱可以增加卵巢癌细胞的放射敏感性.结论 血根碱可以显著抑制卵巢癌SK-OV-3细胞的生长,诱导细胞凋亡和周期阻滞,而且在低剂量下,血根碱可以增加卵巢癌细胞的放射治疗敏感性.
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烷基-去-血根碱-N5-甲基衍生物的合成及肿瘤细胞株生长抑制活性评价
采用汇聚合成方式,分别以6-溴-2,3-二羟基苯甲醛、5-硝基-2,3-萘二酚和二溴甲烷为起始原料,经二氧-去-二溴亲核取代反应、还原反应、席夫碱生成反应以及三丁基锡烷和AIBN诱导的自由基关环反应等反应合成2∶3,7∶8-双亚甲二氧基苯并[c]菲啶;以2∶3,7∶8-双亚甲二氧基苯并[c]菲啶为中间体,以NaBH4和不同的脂肪酸为烷基化试剂,合成5,6-二氢-2∶3,7∶8-双亚甲二氧基-N5-烷基苯并[c]菲啶;以DDQ为氧化剂,在碱性条件下将2∶3,7∶8-双亚甲二氧基-5,6-二氢-N5-烷基苯并[c]菲啶氧化芳构化,并经盐酸盐化反应,得到具有系列性特征的目标化合物2,3∶7,8-双亚甲二氧基-N5-烷基苯并[c]菲啶-5-阳离子季铵盐.与阳性对照药物以及天然血根碱对比,本文合成的系列烷基-去-血根碱-N5-甲基型血根碱类似物在体外显示出明显获得改善的肿瘤细胞株生长抑制活性;在对5种肿瘤细胞株进行的药理实验中,与血根碱比较,目标化合物的活性提高5倍;表明了对血根碱-N5-甲基进行长链烷基的替换修饰,可以通过增加脂溶性和空间位阻、提高5,6-位亚胺结构的稳定性而改善其肿瘤细胞株生长抑制活性.
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血根碱致钉螺肝脏差异表达基因的鉴定
目的 鉴定血根碱致钉螺肝脏差异表达的基因.方法 浓度梯度法测定血根碱浸杀钉螺的半数致死浓度(LC50);以80％ LC50血根碱浸泡钉螺,分离血根碱组和清水组活钉螺肝脏;提取mRNA,逆转录为cDNA,进行抑制消减杂交;巢式PCR扩增差异cDNA,克隆至pMD-l8T载体,PCR和测序鉴定,NCBI中blastx比对分析表达序列标签(expressed sequencetag,EST).结果 血根碱浸杀钉螺LC50为7.5 mg/L.获得的EST序列大小在150～450 bp,经blastx比对,表达上调的基因有α-4 (Ⅵ)胶原链、α-5 (Ⅵ)胶原链、40 S核糖体蛋白S19、假定蛋白(WP_ 009787 197.1)、kelch样蛋白、颗粒体样蛋白;表达下调的基因有β-微管蛋白、α-淀粉酶1、大亚基核糖体蛋白L23e、几丁质酶-1、捷蛋白-3、假定蛋白(EKC34 262.1)、线粒体乙醛脱氢酶、肽聚糖识别蛋白、真核转录延长因子1A、铁蛋白、去整合素金属蛋白酶、溶菌酶1、1,3(4)-β-葡聚糖酶1、血蓝蛋白α-4D亚基,这些基因编码蛋白的功能涉及物质转运、蛋白合成、增殖诱导、营养、抗氧化、抗炎、呼吸、信号转导等.结论 血根碱处理导致钉螺肝脏基因表达发生改变.
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博落回抗肿瘤作用及诱导人体端粒DNA形成G-四链体分子机制研究
目的 从博落回的2个主要活性成分血根碱(San)和白屈菜红碱(Che)入手研究博落回的抗肿瘤作用分子机制.方法 采用MTT法测定San与Che对3种肿瘤细胞(肺癌细胞A-549、结肠癌细胞HCT-8、肝癌细胞Bel-7402)的IC50值,从而确定这两种成分是否为博落回的抗肿瘤活性成分:采用UV-vis、FL、CD法研究San和Che与人体端粒DNA(HT4)的相互作用.结果 San与Che对肿瘤细胞有不同能力的杀伤作用,说明该2种成分是博落同的抗肿瘤活性成分;San和Che能够与HT4相互作用,可以得出San与HT4的结合常数为5×108,并能诱导单链HT4完全形成反平行结构,而Che与HT4的结合常数为930,并能诱导单链HT4部分形成反平行结构.结论 博落同含有的2种活性成分San和Che具有诱导人体端粒DNA形成G-四链体结构的能力,从而抑制端粒酶活性,达到抑制肿瘤细胞增殖的目的,这可能是博落回抗肿瘤的分子机制之一.
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用正交试验法优选小果博落回生物碱的提取工艺
小果博落回Macleaya microcarpa (Maxim)Fedde系罂粟科博落回属植物,其地上部分具有清热解毒、杀虫止痒之功效[1],文献报道[2]其有效成分主要为血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)等多种生物碱.目前有关小果博落回生物碱提取工艺的研究未见报道,本研究在前期工作基础上,对乙醇回流提取小果博落回生物碱工艺进行优化.
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RP-HPLC法同时测定胃痛平糖浆中血根碱和小檗碱的含量
目的 建立胃痛平糖浆的质量标准.方法 采用高效液相色谱法对胃痛平糖浆中血根碱和小檗碱进行定量分析.色谱柱:Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6 mm,5um),流动相:乙腈-体积分数为1%的三乙胺水溶液(体积比为25:75,三乙胺水溶液用磷酸调pH值3),流速:1 mL·min-1,检测波长:263 nm,柱温:30℃.结果 血根碱和小檗碱的平均回收率分别为98.8%和99.7%.RSD分别为2.0%和1.7%.结论 RP-HPL法可用于测定胃痛平糖浆中血根碱和小檗碱的含量.
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博落回果实药材质量标准研究
目的:制定博落回果实药材质量标准,为该药用植物资源的开发利用提供科学依据.方法:生药学研究,理化鉴别,醇浸出物测定法,紫外/可见分光光度法,薄层色谱法及HPLC色谱法.结果:对博落回果实的性状、显微特征进行了描述;对6个不同产地及收集时间博落回果实的醇浸出物进行了测定;同时对其活性成分血根碱和白屈菜红碱进行了薄层定性鉴别和HPLC定量研究.结论:通过研究制定了博落回果实的质量控制标准.
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RP-HPLC法同时测定小果博落回中血根碱和白屈菜红碱的含量
目的:测定小果博落回中血根碱和白屈菜红碱的含量.方法:反相高效液相色谱法.色谱柱:Kromasil C18柱,流动相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(25:75),检测波长:270nm,流速1.0ml·min.结果:白屈菜红碱、血根碱的回收率分别为90.2%,92.8%;RSD分别为1.5%,2.4%.结论:为测定小果博落回中生物碱含量提供了准确、灵敏、可靠的分析方法.
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血根碱对人胃癌细胞GTL-16移植瘤的抑制作用及其机制探讨
目的:观察血根碱(sanguinarine,SAN)在动物体内的抗肿瘤作用,并初步探讨其可能的机制.方法:将人胃癌GTL-16细胞接种于BALB/c雄性裸鼠皮下,建立荷瘤动物模型;并随机分为3组,每组14只,分别用0.9％氯化钠溶液(作为对照组)、2.5和5.0 mg/kg SAN隔天灌胃7次.实验期间观察小鼠一般情况,测量肿瘤大小;28d后处死小鼠,测量肿瘤体积并称质量;采用HE染色法对肿瘤组织进行病理学观察;蛋白质印迹法测定肿瘤组织中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达情况.结果:SAN治疗组小鼠的肿瘤生长明显慢于对照组.用药结束时,SAN组的小鼠肿瘤体积和质量均明显小于对照组,且5.0 mg/kg SAN组的肿瘤体积和质量小;3组之间两两比较的差异均有统计学意义(均P＜ 0.01).组织病理学观察发现,SAN用药显著减少了肿瘤细胞堆积和对表皮的浸润;SAN治疗组肿瘤组织中EGFR蛋白表达水平也显著低于对照组(均P＜0.05).结论:SAN可明显抑制胃癌GTL-16细胞移植瘤小鼠体内的肿瘤生长,推测这可能与下调肿瘤组织中EGFR的表达有关.
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血根碱通过下调DUSP4/ERK通路抑制胃癌细胞生长及侵袭
目的 探讨血根碱对人胃癌细胞株SGC-7901细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其分子机制.方法 以不同浓度血根碱(0、5、10和30 μmol/L)分别处理体外培养的SGC-7901细胞24、48、72和96 h,CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞术测定细胞凋亡;Transwell实验分析细胞侵袭能力;Western blotting检测双特异性磷酸酶4 (DUSP4)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达水平.结果 血根碱抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡;侵袭实验显示,与对照组相比,血根碱处理组侵袭细胞数明显减少.Western blotting检测发现血根碱下调SGC-7901细胞DUSP4、p-ERK、PCNA、MMP-2和Bcl-2蛋白的表达.结论 血根碱能够通过下调DUSP4/ERK通路抑制人胃癌细胞增殖和侵袭,并促进细胞凋亡.
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血根碱脂质体的制备与大鼠体内药动学
目的: 制备血根碱脂质体并研究其在大鼠体内的药动学.方法: 采用硫酸铵梯度法制备血根碱脂质体.大鼠尾静脉注射血根碱脂质体或血根碱溶液,血浆样品用甲醇沉淀蛋白提取,以白屈菜红碱为内标,HPLC法测定.应用Kinetica4.4拟合数据,求算药动学参数.色谱条件如下:采用色谱柱Zorbax SB-C18(250mmx4.6mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(30∶70),流速1mL·min-1,荧光检测激发波长475nm,发射波长为577nm.结果: 溶液组和脂质体组的t1/2,β分别为62.44min、73.65min,AUC 分别为 120.5mg·min·L-1、182.2mg·min·L-1,经t检验两组有显著差异.结论: 上述方法能够准确、灵敏地检测血浆中的血根碱.血根碱制备成脂质体后在大鼠体内消除变慢,生物利用度增加.
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血根碱对人类宫颈癌细胞生长和转移的抑制作用
目的 利用官颈癌细胞株探讨血根碱(SAN)的抗肿瘤作用.方法 采用MTT、克隆形成及细胞划痕试验研究不同浓度SAN对体外培养的人类宫颈癌HeLa和Siha细胞的影响.结果 经1.0 μmol/L和5.0μmol/L SAN处理后,Siha细胞的存活率分别为对照组的72%和10%(P＜0.01).HeLa细胞比Siha细胞更敏感.用1.0 μmol/L SAN处 理后,HeLa和Siha细胞的克隆形成数从33个降低到14个和16个(P＜0.05).划痕试验显示培养48 h后,HeLa细胞和Siha细胞的"细胞伤口"宽度对照组分别为(0.51±0.04)mm和(0.64±0.02)mm,而0.5 μmol/L SAN处理组为(1.22±0.02)mm和(1.63±0.01)mm(分别P＜0.01和P＜0.05).MTT、克隆形成及细胞划痕试验均呈剂量和时间依赖性.结论 SAN可抑制宫颈癌细胞的牛长和转移.该研究为SAN作为一种新药应用于宫颈癌的治疗提供了初步的实验依据和理论基础.
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血根碱对脂多糖致H9c2细胞氧化损伤的改善作用
目的 观察血根碱(sanguinarine,SAN)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的H9c2细胞氧化应激的影响,并对其与HO-1/NOX2途径之间的关系进行探讨.方法 不同因素干预H9c2细胞后,采用细胞活性试剂盒检测不同浓度SAN和/或LPS对H9c2细胞生存的影响;酶标仪及荧光显微镜检测SAN对LPS诱导细胞产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)的影响;Real time RT-PCR检测SAN对LPS诱导的NOX2、P47PHO、HO-1、SOD1、SOD2基因表达的影响;MDA检测试剂盒检测MDA的变化.结果 单用SAN对H9c2细胞活性无影响,LPS可显著降低细胞活性,而SAN与LPS共同干预则可呈浓度依赖性地提高细胞活性,降低ROS产生.LPS处理12 h上调H9c2细胞NOX2、p47phoxmRNA表达、下调HO-1 mRNA表达;SAN预处理后,细胞内NOX2、p47phoxmRNA下调、HO-1 mRNA上调,而SAN与锌原卟啉IX预处理则可逆转这种现象.SAN上调SOD1及SOD2 mRNA表达,降低MDA产生.结论 SAN可通过活化HO-1/NOX2途径,抑制ROS的产生,从而使H9c2细胞免受LPS介导的损伤,提高细胞活力.
