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血根碱通过调控PI3K/Akt信号通路诱导胰腺癌细胞凋亡的机制
目的:探讨血根碱对胰腺癌细胞凋亡的影响及其信号通路调控机制.方法:不同浓度血根碱(2,4,6 μmol·L-)处理小鼠胰腺癌Panc02细胞不同时间(24,48,72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测血根碱对细胞生长抑制作用的影响;采用磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染色试剂盒通过流式细胞仪检测血根碱对Panc02细胞凋亡影响;采用花青染料(JC-1)探针试剂盒荧光染料分析检测线粒体膜电位的变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),总蛋白激酶B(Akt),磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),总磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)的表达情况.结果:与空白组比较,不同浓度的血根碱作用同一时间后,随着药物浓度的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P＜0.05),与空白组比较,同一浓度作用不同时间后,随着时间的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P＜0.05);与空白组比较,血根碱2 μmol·L-组的细胞凋亡率无明显升高,与空白组比较,血根碱4,6μmol·L-组的细胞凋亡率均明显升高(P＜0.05);与空白组比较,血根碱2 μmol· L-1组时红绿荧光无变化,血根碱4,6 μmol·L-组红色荧光减弱,绿色荧光增强,Panc02细胞线粒体膜电位降低;与空白组比较,血根碱2μmol· L-组处理的Bax,Bcl-2,p-PI3K,p-Akt,Akt和PI3K蛋白表达均无变化,血根碱6 μmol·L-组Bax蛋白表达增高,Bcl-2及PI3 K/Akt信号通路中关键蛋白p-PI3K,p-Akt表达降低(P＜0.05).结论:血根碱通过抑制PI3 K/Akt信号通路有效地诱导小鼠胰腺癌Panc02细胞经线粒体凋亡途径发生凋亡.
关键词： 胰腺癌 血根碱 细胞凋亡 Panc02细胞 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路 -
机械张应变诱导的大鼠血管平滑肌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路相关基因的筛选
目的 筛选机械张应变诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的相关基因.方法 应用FX-4000T 细胞应变加载系统,对大鼠主动脉VSMCs施加1 Hz、10 % 张应变,Western blotting检测细胞在不同加载时间下Akt磷酸化水平的变化;用抑制消减杂交法(SSH) ,筛选给予PI3K的抑制剂Wortmannin和给予DMSO 两组细胞在加载张应变24 h后的差异表达基因片段,得到的消减杂交产物连接到T 载体上,经过蓝白斑筛选,对所有阳性克隆进行菌液PCR筛选及测序,应用BLASTN进行序列比对.结果 机械张应变改变了VSMCs磷酸化Akt水平;SSH所获得的54个克隆随机挑选30个送测序,得到10个不同差异表达序列标签(EST),发现6个EST代表的大鼠基因可能与机械张应变诱导的VSMCs PI3K/Akt信号通路相关,它们是:High mobility group box 1(HMGB1), Neural precursor cell expressed(Nedd4a ), Cyclin-dependent kinase 5(CDK5), Histone deacetylase 3(HDAC3), Ubiquitin-like 1(Uble1a), Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1(hnRNP).结论 SSH有效筛选到了机械张应变诱导的VSMCs PI3K/Akt信号通路的相关基因,为进一步研究机械张应变诱导的血管病理生理改变提供了资料.
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磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路与神经退行性疾病
神经退行性疾病是中枢神经系统内神经元结构和功能进行性丢失导致神经元死亡的一类疾病,常见的包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)和肌萎缩侧索硬化(ALS).磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是细胞内重要的促生存信号通路,广泛存在于各种细胞.在生长因子、细胞因子及其他外界刺激下该通路被激活,调节细胞增殖、分化、生长、存活、代谢、迁移、膜转运等多种细胞生物学活动.近来研究发现,PI3K/Akt信号通路异常可能是AD、PD、HD和ALS等神经退行性疾病发病的基础.
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奥氮平抑制Aβ淀粉样蛋白25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用
目的 探讨奥氮平对Aβ淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导PC12细胞损伤的保护作用.方法 将PC12细胞随机分为对照组、模型组、低中高3个剂量实验组.模型组和实验组用10μmol·L-1 Aβ25-35诱导PC12细胞,构建氧化应激模型.低、中、高剂量实验组分予以10,30,100 μg· mL-1奥氮平培养,对照组和模型组予以不含任何药物的培养基.用噻唑蓝法检测细胞活力,用Hoechst染色法检测细胞凋亡情况,用分光光度法检测Caspase 3活性,用Western blot法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)含量及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3 K/AKT)通路的激活状况.结果 对照组、模型组和低中高3个剂量实验组的细胞活力分别为(100.00±9.35)％,(58.46 ±5.59)％,(67.43 ±6.52)％,(76.31 ±7.60)％,(89.21±8.85)％;Caspase 3活性分别为(1.00 ±0.12),(3.48 ±0.35),(2.85 ±0.28),(2.03 ±0.20),(1.34±0.13)U·mg-1;Bel-2表达量分别为(0.68±0.06),(0.24±0.02),(0.38 ±0.04),(0.63±0.06),(0.69±0.07);Bax表达量分别为(0.27 ±0.02),(0.82 ±0.08),(0.63±0.06),(0.43 ±0.04),(0.30±0.03);PI3K表达量分别为(0.89 ±0.08),(0.22 20.02),(0.34士0.03),(0.50 ±0.05),(0.54 ±0.05);p-AKT表达量分别为(2.32±0.22),(0.28±0.02),(0.27±0.02),(1.88 ±0.18),(2.00±0.20);p-CREB表达量分别为(2.79±0.24),(0.18±0.01),(0.14±0.01),(0.47±0.04),(0.50±0.05);其中模型组的上述指标与对照组比较,差异均均有统计学意义(均P＜0.01),低中高3个剂量实验组的细胞活力、Caspase 3活性、Bel-2、Bax及PI3K表达量与模型组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.01),中、高剂量组p-AKT及p-CREB表达量与模型组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 奥氮平对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有显著的保护作用,可能与激活PDK/AKT信号通路有关.
关键词： 奥氮平 PC12细胞 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路 -
磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B信号通路对MC3T3-E1细胞增殖和周期调控的研究
目的：近年的研究显示，磷脂酰肌醇3激酶（ phosphoinositide 3-kinase， PI3K）/蛋白激酶B（ protein kenase B， PKB/Akt）信号通路是骨形成和骨重建的关键调控信号，文中研究抑制PI3K/Akt信号通路后对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响。方法用PI3K/Akt信号抑制剂PF-04691502处理MC3T3-E1细胞后，通过MTS法检测细胞增殖的活性，流式细胞仪检测细胞周期的变化，Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果应用抑制剂抑制PI3K/Akt信号通路后，与对照组细胞存活率（100±5．6）％比较，30、150、750 nmol/L的MC3T3-E1细胞增殖活性明显降低[（64．7±4．1）％、（42．3±1．1）％、（15．9±0．4）％， P＜0．01]，且随着药物浓度的增加，细胞增殖活性降低越明显。同时，与对照组比较，1μmol/L PF-04691502处理组sub-G1期细胞比例明显升高[（1．45±0．43）vs（0．27±0．21）， P＜0．01]，且细胞周期蛋白D1表达降低。结论抑制PI3K/Akt信号通路能将MC3T3-E1细胞阻滞于G1期，能降低细胞的增殖能力。
关键词： 成骨细胞 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路 细胞周期 增殖活性 -
抵抗素通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导H9c2心肌细胞肥大机制研究
目的 探讨抵抗素激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3 K/Akt)信号通路诱导H9c2心肌细胞肥大的分子机制.方法 取生长状态良好的H9c2心肌细胞,使用含1g·L-1胎牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)处理24h使其细胞同步化后进行不同干预.随机将H9c2心肌细胞分为Con组、R50组、LY294002+ R50组和LY294002组,Con组为空白对照;R50组细胞应用50 μg·L-1抵抗素处理48 h组;LY294002+ R50组细胞预先应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002干预2h后再用50 μg·L-1抵抗素处理46 h;LY294002组细胞应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理2h组.4组心肌细胞加含药物DMEM培养48 h后进行细胞面积、单细胞蛋白质合成量测定,Western blot检测心肌细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、原癌基因c-myc蛋白及PI3K/Akt非磷酸化及磷酸化水平表达.观察抵抗素(50 μg·L-1)处理细胞不同时间(0、1、2、3h)后运用Western blot测定磷酸化(p-Akt)的蛋白表达水平,检测抵抗素处理1h后4组心肌细胞PI3K/Akt信号通路磷酸化表达水平.结果 抵抗素处理H9c2心肌细胞0、1、2、3h组p-Akt蛋白表达水平分别为0.60±0.26、0.71±0.67、0.52±0.32、0.51±0.32;与0h组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞1h组p-Akt蛋白表达水平显著增高(P＜0.01);与1h组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞2、3h组p-Akt蛋白表达水平显著降低(P＜0.01);抵抗素处理H9c2心肌细胞2h与处理3h后H9c2心肌细胞中p-Akt蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).抵抗素处理H9c2心肌细胞48 h后,与Con组比较,R50组、LY294002+ R50组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平显著升高(P＜0.05),而LY294002组其心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05);与R50组比较,LY294002+ R50组、LY294002组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05);与LY294002+ R50组比较,LY294002组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05).Con组、R50组、LY294002+ R50组、LY294002组c-myc蛋白表达水平分别为0.45±0.30、0.68±0.32、0.56±0.33、0.16±0.20,4组间比较差异有统计学意义(F=178.91,P＜0.05);与Con组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞48 h后,R50组c-myc蛋白表达水平显著增高(P＜0.05);而LY294002+ R50组c-myc蛋白表达水平较Con组、LY294002组升高但低于R50组(P＜0.05).经抵抗素处理H9c2心肌细胞3h后,R50组PI3 K/Akt信号通路磷酸化水平较Con组、LY294002+ R50组、LY294002组显著升高(P＜0.05),其余各组PI3K/Akt信号通路磷酸化水平表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 抵抗素通过激活PI3K/Akt通路,提高Akt磷酸化水平来诱导H9c2心肌细胞肥大.
关键词： 抵抗素 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路 心肌肥厚 -
丙戊酸对大鼠创伤性颅脑损伤后脑水肿和神经功能的影响
目的 观察丙戊酸对大鼠创伤性颅脑损伤后脑水肿的影响及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在其中的作用.方法 采用Feeney法建立大鼠创伤性脑损伤模型.72只健康雄性成年SD大鼠,采用随机数字表法分为4组(n=18):假手术组(Sham组)、创伤性颅脑损伤组(TBI组)、TBI+丙戊酸处理组(TBI+ VPA组)和TBI+ PI3K特异性抑制剂LY29400组(TBI+ LY组).分别于伤后1、3、7d进行神经行为学评分(mNSS);采用干湿重法测损伤区脑组织脑水含量;免疫荧光染色测定脑组织中组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达;Westerrn blot检查脑组织HDAC1、MMP-9和PI3K/Akt信号通路相关蛋白(PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt)表达水平的变化.结果 建模后第1、3、7天,与Sham组比较,TBI、TBI+ VPA、TBI+ LY组的mNSS评分显著升高,脑水含量显著增高;TBI、TBI+ VPA、TBI+ LY组脑组织HDAC1、MMP-9和PI3K/Akt通路相关蛋白表达均显著上调(P＜0.01).模型建立后第3、7天,与TBI组比较,TBI+ VPA组和TBI+ LY组的mNSS评分显著低于TBI(TBI+ VPA组:10.83±0.48比12.04 ±0.51、P＜0.05,8.55±0.29比10.73±0.42、P＜0.05;TBI+ LY组:10.24±0.38比12.04±0.51,P＜0.05,7.83±0.26比10.73±0.42,P＜0.01);脑组织含水量显著降低[TBI+VPA组:(80.01±0.61)％比(82.87±0.69)％,P ＜0.05,(75.88±0.52)％比(78.33±0.41)％,P ＜0.05;TBI+ LY组:(79.59±0.57)％比(82.87±0.69)％,P＜0.05,(74.94±0.43)％比(78.33±0.41)％,P＜0.01].模型建立后第3天,与TBI组比较,TBI+ VPA组和TBI+ LY组脑组织HDAC1和MMP-9蛋白,PI3K/Akt通路中p-PI3K和p-Akt表达下调(P＜0.05).结论 丙戊酸可减轻大鼠创伤性脑损伤后脑水肿,改善伤后神经功能,其机制可能与抑制脑组织PI3K/Akt信号通路活化,降低MMP-9的表达相关.
关键词： 创伤性颅脑损伤 丙戊酸 脑水肿 神经保护 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路 -
二氮嗪对深低温低流量小鼠脑的保护作用
目的 观察不同浓度二氮嗪对深低温低流量脑缺血再灌注小鼠模型的脑保护作用,探讨二氮嗪发挥脑保护作用的机制.方法 将240只3周龄的C57/BL-6健康小鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(m)、二氮嗪(2、5、10 mg/kg)组、渥曼青霉素+二氮嗪(2、5、10 mg/kg)组共8组,每组30只.每组再平均分为再灌注2、24、72 h 3个亚组,每个亚组再平分为蛋白质组和脑组织大体标本组,小组以5只为单位.根据要求建立深低温低流量动物模型,于再灌注不同时间点取小鼠脑组织.应用Western blot技术分别检测各组脑组织中总蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)的表达变化.对各组脑组织进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,观察脑组织损伤程度.结果 再灌注24h二氮嗪组p-AKT、p-GSK-3β与其他组比较表达增高,差异有统计学意义(P＞0.05)；再灌注24 h和72 h 2 mg/kg组与其他二氮嗪组比较表达增高,差异有统计学意义(P＜0.05).TTC染色结果显示再灌注24 h二氮嗪组与其他组比较脑损伤减轻,差异有统计学意义(P＜0.05)；再灌注24 h和72 h 2 mg/kg组与其他二氮嗪组比较脑损伤减轻,差异有统计学(P＜0.05).渥曼青霉素+二氮嗪组与模型组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 二氮嗪对深低温低流量小鼠模型有脑保护作用,其发挥作用的机制可能是通过激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT信号通路,进而调节AKT下游蛋白糖原合成激酶-3β(GSK-3β)的磷酸化水平而实现的.
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PI3K/AKT信号通路与恶性胶质母细胞瘤侵袭性
源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤,占颅脑肿瘤的40％～50％,是常见的颅内恶性肿瘤.根据病理可分为星形细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶母细胞瘤、室管膜瘤和少枝胶母细胞瘤等.多形性胶质母细胞瘤(GBM)是致死性高的肿瘤之一,也是成年人中常见的脑肿瘤,占颅内肿瘤的12％～15％和星形胶质细胞瘤的50％～60％,在大多数欧洲和北美洲国家中,每年新增病例为2～3人/10万;在全身肿瘤中GBM的5年死亡率仅次于胰腺癌和肺癌,居第3位,5年生存率不足5％.
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蛇床子素通过PI3K-AKT信号通路诱导HaCaT细胞凋亡的研究
目的 观察蛇床子素对人永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)增殖和凋亡的影响并探讨其相关机制.方法 采用CCK-8法检测HaCaT细胞增殖情况;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;流式细胞仪检测HaCaT细胞周期变化及细胞凋亡水平;采用Western blotting检测蛇床子素对HaCaT细胞磷酸肌醇3激酶(PI3K),人磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K),蛋白激酶B(AKT),磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白以及通路下游凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl相关X蛋白(Bax),Cleaved-caspase3表达的影响.结果 在所选质量浓度范围内(20、40、60 μg/mL),蛇床子素对HaCaT细胞的增殖有明显抑制作用且能显著促进HaCaT细胞的凋亡;其中,20、40、60 μg/mL质量浓度组蛇床子素可明显抑制PI3K和AKT的磷酸化,但对PI3K和AKT的表达无明显影响;蛇床子素能促进促凋亡蛋白Bax,Cleaved-caspase3的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.结论 蛇床子素能抑制HaCaT细胞增殖,促进细胞凋亡,可能与其能抑制PI3K和AKT的磷酸化,阻断PI3K-AKT通路,激活下游相关促凋亡蛋白有关.
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阿立哌唑对Aβ25-35诱导的神经PC12细胞损伤的影响及机制
目的:研究阿立哌唑对Aβ淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导的神经PC12细胞损伤的影响及其机制.方法:将PC12细胞随机分为正常对照组、模型组(20μmol/L Aβ25-35)和阿立哌唑低、中、高浓度组(5、10、20μmol/L阿立哌唑+20μmol/L Aβ25-35),加入含相应药物的培养基培养48 h,每组6个复孔.MTT法检测细胞活力(光密度值),Hoechst染色法检测细胞凋亡情况,分光光度法检测细胞中天冬氨酸特异性蛋白酶3(Caspase-3)、Caspase-9活性,Western blot法检测细胞中B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)蛋白表达及蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平.结果:与正常对照组比较,模型组细胞光密度值降低,凋亡率增加,Caspase-3、Caspase-9活性和Bax蛋白表达均增强,Bcl-2、PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平均降低(P<0.01).与模型组比较,阿立哌唑低、中、高浓度组细胞光密度值增加,凋亡率减少,Caspase-3、Caspase-9活性减弱,Bcl-2、PI3K蛋白表达和Akt磷酸化水平均增加;阿立哌唑中、高浓度组细胞Bax蛋白表达减弱(P<0.05或P<0.01).结论:阿立哌唑可明显抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,其作用可能与激活PI3K/Akt信号通路有关.
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A型肉毒毒素对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用及机制
目的 探讨A型肉毒毒素(BTXA)对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用及机制.方法 0(对照组)、0.2、0.4、0.8U/mL的BTXA作用于增生性瘢痕成纤维细胞48 h,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,Hoechst染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期,免疫印违法分析细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路的激活状况.结果 与对照组(0,75±0.07)比较,0.2、0.4、0.8 U/mL的BTXA(0.59±0.06、0.43±0.04、0.34±0.03)可明显降低增生性成纤维细胞活力;与对照组[(2.38±0.24)％]比较,可显著提高细胞凋亡率[(15.79±1.54)％、(27.32士2.69)％、(38.46±3.90)％];下调Cyclin D1及PCNA表达,降低PI3K表达及AKT磷酸化水平,并使细胞周期阻滞在G1期,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论BTXA可通过阻断PI3K/AKT信号通路及细胞周期蛋白表达,进而抑制增生性细胞增殖.
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FoxO转录因子与红细胞信号通路的研究进展
红细胞的生成是个复杂的过程，通过激活干细胞因子／干细胞因子受体（stem cell factor／stem cell factor receptor ，SCF／c‐kit）和促红细胞生成素／促红细胞生成素受体（erythropoie‐tin／erythropoietin‐receptor ，EPO／EPOR）通路，完成红细胞生长发育。叉头状转录因子（forkhead transcription factor ， FoxO）是一个与红细胞关系密切的转录因子。磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（phosphoinositide 3‐kinase／protein kinase B ， PI3K／PKB）通路是红细胞信号转导中 SCF／c‐kit 和 EPO／EPOR通路共同的一条通路，FoxO受PI3K／PKB磷酸化级联通路的调节，其活性与磷酸化状态直接相关。PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，其产物可作为第二信使在细胞中传递信号，介导细胞的信号转导。FoxO转录因子与红细胞信号通路关系密切，本文主要针对FoxO转录因子与红细胞信号通路关系的研究进展进行综述。
