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弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达
目的 体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4(GRA4)基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4,重组耻垢分枝杆菌,鉴定重组蛋白的抗原性. 方法 用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因,克隆入pGEM-T载体,然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2 155)中,用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠,Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体. 结果 成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4,Western blot分析显示,GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别,分子质量单位约为40.0 ku. 结论 重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4,具有抗原性,刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体,为弓形虫重组BCG(Bacillus Calmette-Guerin)疫苗的研究奠定了基础.
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弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究
目的用pVAC-GRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护作用.方法大量制备pVAC-GRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠3次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照.于末次免疫4周后作免疫指标测定(包括MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群数目、双夹心ELISA法测定细胞因子IFN-γ及IL-4含量、间接ELISA法测定IgG抗体滴度),并观察攻毒试验后小鼠存活情况.结果脾淋巴细胞增殖各组间差异无显著性(P>0.05); pVAC-GRA4组CD4+T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD8+T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD4+/CD8+比值也较空白对照组明显降低(P<0.01); pVAC-GRA4免疫组IFN-γ A值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL-4 A值各组间无明显变化(P>0.05);pVAC-GRA4组可诱导产生特异性IgG抗体,但滴度不高; pVAC-GRA4免疫组小鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05).结论用pVAC-GRA4重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导产生以细胞免疫为主的免疫应答及对弓形虫攻击感染的部分保护作用.
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弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达
目的克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因.方法根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2-GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白.结论成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础.
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弓形虫致密颗粒蛋白GRA4真核表达质粒的构建
目的 构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达重组质粒.方法 设计合成GRA4引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4.结果 PCR扩增GRA4基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRa4经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确.结论 成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA4,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础.
