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马来丝虫非放射性寡核苷酸探针的制备及现场应用研究
目的寻找一种高度特异、敏感的马来丝虫的检测方法,并将其用于现场检测. 方法根据马来丝虫HhaⅠ重复序列,合成马来丝虫特异性引物1对和寡核苷酸探针1条,采用地高辛加尾标记试剂盒对人工合成寡核苷酸探针进行非放射性标记,并对标记后的探针进行标记效率检测;将血液标本和蚊虫标本分别用蛋白酶K等处理液和Chelex-100处理后,结合PCR技术,对该探针的特异性和敏感性进行检测;并将此探针用于平远县马来丝虫病的监测. 结果经测定,标记后探针的有效浓度为1.5～2 fmol/μl;结合PCR技术,该探针可检出100 μl阳性血样中1条微丝蚴;50只蚊中含有1只只感染1条幼丝虫阳性蚊亦能准确检出.班氏丝虫等其它寄生虫标本的检测结果均为阴性;采自平远县的240份血液标本和1 008只中华按蚊标本均为阴性. 结论该探针杂交检测方法特异性强,敏感性高,可作为一种新的马来丝虫病监测方法在现场中使用.
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我国不同地区周期型马来丝虫基因组DNA多态性研究
目的分析我国不同地区马来丝虫基因组的多态性.方法用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对我国6省区周期型马来丝虫基因组DNA多态性进行了检测.结果经20个引物扩增得到51个多态片段,6株丝虫共有片段2个,特有片段9个.结论片段共享度及聚类分析所得的6株丝虫的亲缘关系与同工酶、电镜及氨基酸研究的结果基本一致,即地理位置相距近则亲缘关系密切.
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我国不同地区马来丝虫DNA多态性的比较分析
目的分析我国周期型马来丝虫DNA多态性. 方法收集长爪沙鼠保种的湖北谷城(H)株、四川乐山(S)株和浙江安吉(Z)株马来丝虫成虫,提取基因组DNA,采用RAPD技术分析DNA多态性. 结果得到17个DNA扩增片段,大小为50～1 000 bp.其中a、c为H、S、Z株共有条带, d、e、f、g为H、S株共有条带,b、h、i为H株特有条带.结论 RAPD分析3个地区株马来丝虫在基因结构上既有同源性,又存在差异,表明我国马来丝虫似有种内分化的趋向.
关键词： 丝虫 马来 基因组DNA 随机扩增多态性DNA(RAPD) -
马来丝虫病防治后期残存微丝蚴血症者传播作用的纵向观察
目的观察丝虫病防治后期残存微丝蚴血症者的传播作用.方法 1984～1996年,在以嗜人按蚊为主要传播媒介的马来丝虫病流行区,选定3个村为观察区,终止防治措施进行观察.结果人群微丝蚴率≤1.03%、微丝蚴密度大多≤10条/120μl的裕农和台子村,分别在5年和10年微丝蚴率和嗜人按蚊感染率均降为0;微丝蚴率1.36%,微丝蚴密度大多≤20条/120 μl,有极少数较高密度微丝蚴血症者(＞50条/120 μ1)的石头村,于10年后仍有新检出病例和感染蚊,13年后微丝蚴率仍维持在0.27%.结论少数较高密度微丝蚴血症者作为嗜人按蚊感染源作用较强.但随着残存微丝蚴血症者的陆续转阴,微丝蚴密度的降低,人们防蚊意识增强和社会与自然因素的制约,裕农和台子村丝虫病传播已被阻断,石头村丝虫病传播正趋于阻断.
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细胞毒作用前后马来丝虫微丝蚴氨基酸组成及含量的测定分析
目的通过观察马来丝虫微丝蚴(mf)经细胞毒作用后,虫体氨基酸含量的变化,进一步探讨宿主体内的杀虫机制.方法应用高速氨基酸分析仪对细胞毒作用前后的周期型马来丝虫mf进行氨基酸组成及含量的分析比较.结果马来丝虫mf含1 7种氨基酸,缺少色氨酸.经宿主细胞毒作用后的虫体氨基酸绝对含量明显低于细胞毒作用前(P＜0.05).其中,精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸下降显著(P＜0.01).结论虫体氨基酸含量下降,尤其是碱性氨基酸与酸性氨基酸、芳香族氨基酸之间比率下降可能是宿主体内杀伤丝虫mf的机制之一.
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周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂复合基因真核重组质粒的构建与表达
目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氰酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂(GAPDH/CPI)复合基因真核重组表达质粒,为研制复合多价疫苗奠定基础.方法 依据GenBank中BmGAPDH及BmCPI基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克降后,克隆至载体pGEM-T Easy中.取阳性重组质粒pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI以及真核重组表达载体分别双酶切,将酶切后的载体和目的 片段进行连接,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI.将复合基因重组质粒瞬时转染人HeLa细胞后,进行RT-PCR验证,将表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析和鉴定.结果 分别克隆了pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI重组质粒,经酶切鉴定分别得到877、621 bp特异性片段,与预期值吻合.成功构建了复合基因重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI,酶切鉴定所产生的片段大小与预期吻合.复合基因真核重组表达质粒转染HeLa细胞后得到高水平表达,SDS-PAGE分析显示重组蛋白相对分子质量(Mr)约为54×103.结论 成功构建了周期型马来丝虫GAPDH/CPI复合基因重组表达质粒,并在哺乳动物细胞内得到正确表达.
关键词： 丝虫 马来 甘油醛-3-磷酸脱氢酶类 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 重组 遗传 Hela细胞 -
周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究
目的 构建周期型马来丝虫(Bm)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组复合基因真核表达质粒,观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 将重组质粒pGEM-T/BmCPI和pGEM-T/BmG APDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH.将纯化的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次间隔2周.采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因,采用四甲基偶氮唑盐( MTT)法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平.统计学分析采用t检验.结果 pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因.免疫6周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组和pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.466±0.635和1.610±0.112,显著高于PBS组的1.004±0.019和pcDNA3.1(+)-CpG组的1.078±0.129(t=64.438、45.318、42.749、34.314,均P＜0.05).免疫4周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3.1(+)-CpG组(t=288.053、76.453,均P＜0.05),其中IFN-γ水平与pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组相比也有明显提高(t=129.642,P＜0.05).结论 pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达,并可有效诱导特异性细胞免疫应答.
关键词： 丝虫 马来 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 甘油醛-3-磷酸脱氢酶类 基因表达 遗传载体 质粒 -
周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因真核表达载体的构建及DNA免疫研究
目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)真核表达载体pcDNA3.1-BmGAPDH,并观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR方法扩增目的 基因片段.与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆.经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3-BmGAPDH表达载体,将纯化的pcDNA3.1-BmGAPDH和CpG经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次免疫间隔2周.用RT-PCR方法检测肌肉组织内目的 基因;用噻唑蓝(MTT)法、ELISA方法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子IFN-γ、IL-4水平.应用SPSS统计学软件进行样本均数的t检验.结果 成功构建了pcDNA3.1-BmGAPDH真核表达载体,基因片段全长为1020 bp.DNA序列分析与基因库已知基因序列同源性为99%.该真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织扩增出目的 基因重组质粒组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数显著高于PBS对照组及空质粒对照组,淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.398、1. 006和1.017(P<0.05).重组质粒组IFN-γ、IL-4细胞因子水平均高于PBS对照组及空质粒对照组,分别为163.905、58.589、51.317 ng/L和107.906、27.111、34.627 ng/L(P<0.05).免疫佐剂CpG与疫苗同时注射可增强机体的免疫应答,表现为IFN-γ水平和免疫4周后淋巴细胞刺激增殖指数显著上升.结论 pcDNA3.1-BmGAPDH真核表达载体能在小鼠体内表达并可诱导相关的细胞免疫应答.
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新加坡马来女性社区减重项目的推广研究
目的:评估一项低成本的新加坡马来女性社区减重项目的可行性.方法:①实验设计:从当地女性机构中募集愿意减重的马来女性,通过6个月的社区活动以改良其生活方式,每个月人均花费34美元.②参与人员:共有142名马来女性参加本研究,其中112名女性[BMI (29.0±5.7) kg/m2]完成.③干预方法:参加人员自愿选择膳食替代法,其中59名女性每天进行1次膳食替代.④结果指标:在干预前、3个月和6个月后分别进行人体测量和空腹生化指标测试.结果:干预3个月后每天选择1次膳食替代的女性的腰围和空腹血糖显著下降,干预6个月后选择膳食替代法女性的体重维持效果好于未选择膳食替代法的女性.结论:社区减重项目结合膳食替代法对于身体代谢有良好效果,并且成本低,具有可行性.
