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dsRNA抑制SAG3表达对弓形虫入侵蛋白ROP2、MIC2的影响
目的 观察表面抗原3(SAG3)对弓形虫入侵相关蛋白的影响,为深入研究弓形虫的致病机制奠定基础.方法 用电穿孔的方法将针对SAG3基因3′-UTR区的dsRNA转入弓形虫速殖子体内,转染后的虫体感染Hela细胞,转染后2 h提取总RNA,RT-PCR检测SAG3的抑制效率,同时检测弓形虫入侵蛋白ROP2、MIC2的表达情况.结果 dsRNA电穿孔转染弓形虫速殖子后抑制SAG3 mRNA表达,ROP2、MIC2的表达量显著低于对照组.结论 抑制SAG3的表达影响ROP2、MIC2的表达.
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弓形虫棒状体蛋白2多克隆抗体制备纯化及其在免疫荧光定位中的运用
目的 制备弓形虫棒状体蛋白2 (ROP2)多克隆抗体并纯化. 方法 将已构建的重组质粒pET32a-ROP2转化人大肠埃希菌(E.coli) BL21 (DE3)中,用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白ROP2,分离上清和包涵体,包涵体洗涤后,用尿素溶解；取纯化蛋白与等体积福氏完全佐剂或不完全佐剂混合,背部皮下免疫新西兰大白兔3次,200 μg/次,3次免疫之间分别间隔14d和19d,末次免疫10d后收集兔血清,亲和纯化柱纯化,并用间接ELISA检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析抗体特异性.将弓形虫速殖子感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞),利用制备所得的多克隆抗体采用免疫荧光法检测ROP2在感染细胞中的定位.结果 通过诱导表达,获得重组蛋白ROP2,制备的兔源性ROP2抗体纯化后为单一蛋白抗体.间接ELISA结果显示,抗体滴度为1∶102 400; Western blotting结果显示,抗体特异性良好.同时,免疫荧光定位试验结果显示,ROP2定位在弓形虫的纳虫泡膜上. 结论 本研究制备并纯化了抗弓形虫ROP2的兔源性多克隆抗体,并成功应用于ROP2在弓形虫纳虫泡膜上的免疫荧光定位试验.
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西咪替丁伍用弓形虫ROP2蛋白免疫小鼠诱导免疫反应的初步研究
目的 观察西眯替丁伍用弓形虫棒状体蛋白2 (ROP2)免疫小鼠诱导的免疫反应.方法 80只BALB/c小鼠随机分为A组、B组、C组和D组,各组分别经皮下注射PBS、弓形虫ROP2蛋白+PBS、弓形虫ROP2蛋白+福氏佐剂和弓形虫ROP2蛋白+西咪替丁[200 mg/(kg·d)]免疫BALB/c小鼠,每次ROP2蛋白免疫剂量为100μg/只(200μl),共免疫3次,每次间隔2周.于首次免疫前和每次免疫后2周,采血分离血清.末次免疫后2周,每组小鼠随机处死8只,无菌分离脾细胞,CCK-8法测定淋巴细胞增殖活性.流式细胞术检测小鼠全血T细胞亚群.ELISA法检测小鼠血清IgG抗体和γ干扰素(IFN-γ)水平.各组剩余12只小鼠经腹腔感染弓形虫RH株速殖子(5×104个/鼠),观察攻击感染后小鼠生存时间.结果 末次免疫后2周,A、B、C和D组小鼠的血清IFN-γ水平分别为(659.750±239.962)、(872.750±197.011)、(1 600.750±480.680)和(1 494.375±451.655) pg/ml,血清特异性IgG抗体水平分别为0.504±0.078、0.592±0.160、1.068±0.111和1.046±0.147,脾细胞增殖活性分别为0.504±0.078、0.592±0.160、0.831±0.130和0.762±0.089,外周血CD4+/CD8+比值分别为0.504±0.078、0.592±0.160、0.831±0.130和0.762±0.089,C和D组均显著高于A和B组(前3个指标,均P＜0.01;后者,均P＜0.05),D组与C组的差异均无统计学意义(P＞0.05).各免疫组弓形虫攻击感染后,A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为96、108、132和132 h,C组和D组小鼠平均存活时间显著长于A组和B组(P＜0.05),D组与C组的相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 西咪替丁可增强ROP2蛋白诱导的细胞免疫和体液免疫反应.
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弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究
目的 研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用.方法 42只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、空质粒组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50μg、pc-DNA3空质粒50μg和PBS 50μl,共免疫3次,每次间隔3周,末次接种量均加倍.末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织,检测CD4+、CD8+及各细胞因子.其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个,观察其存活时间等.结果 ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠的CD4+T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+比值显著升高(4.69±1.32)%(P＜0.01);其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素(IFN-y)和肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高为显著.弓形虫攻击感染180 h后,实验组小鼠免疫保护率为88.9%,与对照组相比,小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟(P＜0.01).结论 ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用.
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弓形虫多基因核酸疫苗构建及其免疫保护性研究
目的 构建弓形虫多基因核酸疫苗,评价其免疫保护性.方法 PCR扩增热休克蛋白(HSP70)基因片段,克隆到pcDNA3-ROP2-p30重组质粒中,构建pcDNA3-ROP2-p30-HSP70多基因核酸疫苗.采用该疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+、CD8+,血清、脾淋巴细胞培养液中IgG、IgM、IgA和IFN-γ、TNF、IL-2、IL-4、IL-12等,并进行弓形虫攻击感染实验.结果 应用PCR扩增出916 bp HSP70基因片段,成功构建pcDNA3-ROP2-p30-HSP70重组体,其中包含.HSP70 蛋白基因读码框内的完整序列.该弓形虫多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫,实验组小鼠血清抗体滴度高,CD4+和CD8+均增殖明显,组间差异有统计学意义(FcD4+=45.00,FCD8+=15.01,P均＜0.01);其血清及脾细胞培养液中IFN-γ、IL-2和IL-12含量均明显升高,尤以血清中升高显著.攻击实验结果显示,实验组小鼠存活时间明显延长.结论 pcDNA3-ROP2-p30-HSP70多基因核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生较好的免疫保护作用.
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弓形虫ROP2基因的体外扩增及克隆
目的构建弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)基因重组质粒.方法根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序.结果ROP2基因体外扩增产物大小约1043 bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与已知序列基本吻合.结论在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究打下了基础.
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弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建
目的构建弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)基因真核表达重组质粒.方法根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRⅠ、SdⅠ酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-l质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoRⅠ、Not Ⅰ双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2.结果ROP2基因体外扩增产物大小约1 043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合.结论在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础.
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弓形虫ROP2酵母双杂交诱饵表达载体构建及毒性和自激活活性检测
目的 为筛选弓形虫分泌毒性因子-棒状体蛋白2 (ROP2)在终末宿主细胞内的互作因子,构建ROP2的酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其表达蛋白对酵母菌生长的毒性作用及自激活活性.方法 根据ROP2蛋白的特性选取1～ 561氨基酸、25～241氨基酸、242～ 561氨基酸作为目的片段,PCR扩增弓形虫基因组获得3片段,定向克隆到酵母表达载体pGBKT7上,经测序正确后,将其转化到酵母菌Y187感受态细胞,在缺陷性培养基上观察3个诱饵表达载体在Y187中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.结果 成功扩增出ROP2基因的3个目的片段,并将其克隆到诱饵表达载体pGBKT7中,经测序及酶切鉴定结果正确,转化到酵母Y187细胞中的诱饵表达载体无毒性和自激活作用.结论 成功获得了对宿主酵母细胞无毒性且未自主激活活性的诱饵表达载体pG-BKT7-ROP21-561、pGBKT7-ROP2242-561、pGBKT7-ROP225-241,可作为酵母双杂合系统中的“诱饵”,为下一步利用酵母双杂交系统筛选ROP2在终末宿主细胞内的相互作用蛋白创造了条件.
