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日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T/A克隆及序列分析
目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列,为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子.方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK) cDNA 序列设计1对引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,从日本血吸虫成虫总RNA中扩增 SjPGK 基因片段.利用T/A克隆法,将其克隆入 pMD18-T 载体,经双酶切分析和 PCR 鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI 数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较.结果 RT-PCR 特异性扩增出1条长约830 bp大小的条带;经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18-T-SjPGK中含有所扩增的基因序列;脱氧核糖核酸序列测定和分析,SjPGK 基因片段长为830 bp,与 SmPGK 的核苷酸同源性为85%,分值为 672;氨基酸同源性为94%,分值为473.结论成功克隆SjPGK 编码基因片段,为进一步实验提供了条件.
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食管鳞癌肿瘤相关抗原磷酸甘油酸激酶1的鉴定
目的:鉴定新的食管鳞癌肿瘤相关抗原.方法:食管癌EC0156细胞总蛋白先经亚组分预分离,有效富集胞质、胞膜和胞核等组分蛋白;胞质组分蛋白经SDS-PAGE分离后分别与食管癌患者血清或健康志愿者血清共孵育,分离血清结合蛋白条带;胶内酶解阳性蛋白条带,肽段经色谱分离后用SynaptTM HDMS质谱鉴定.候选蛋白进一步Western blot经免疫组化验证.结果:总蛋白经亚组分分离后,不同组分蛋白均得到有效富集.食管癌患者血清能与EC0156细胞胞质蛋白结合,即选择性识别肿瘤相关抗原.其中,43kDa蛋白条带与食管癌血清(41.4%,12/29)和对照(3.6%,1/28)结合阳性率具有明显差异.从该蛋白条带中共鉴定到磷酸甘油酸激酶、β-actin、蛋白酶体26s亚基、S-腺苷高半胱氨酸水解酶和磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶5个高可信度蛋白.磷酸甘油酸激酶(PGK1)定位于胞质和胞核,在食管癌组织中高表达(69.23%,18/26).结论:改良血清蛋白质组分析策略(mSERPA)可有效分离鉴定肿瘤相关抗原.PGK1是食管癌候选肿瘤相关抗原,在食管癌发生发展中可能发挥重要作用.
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人PGK1基因真核表达载体的构建及其功能检测
目的 构建带FLAG标签的人癌基因磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase1,PGK1)的真核表达载体,并验证其表达产物的生物学功能.方法 采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人PGK1基因,并将其克隆到真核载体pcDNA3.0-FLAG上,酶切鉴定和测序鉴定后,通过Western印迹检测其表达;将FLAG-PGK1载体转染乳腺癌细胞ZR75-1,利用乳酸试剂盒测定乳腺癌细胞外乳酸含量,并通过CCK8法和划痕实验测定乳腺癌细胞的生长和迁移.结果 从乳腺文库中,PCR扩增出约1260 bp DNA片段,克隆到pcDNA3.0-FLAG载体上,测序结果与目的序列一致.Western印迹检测到目的基因表达,且位置正确.乳酸含量测定结果显示,PGK1可促进细胞乳酸含量增加;细胞生长曲线结果显示,转染FLAG-PGK1的乳腺癌细胞生长较空载体生长快;细胞划痕实验表明PGK1促进细胞迁移.结论 成功构建了FLAG-PGK1的真核表达载体,其表达促进了乳腺癌细胞生长和迁移,同时也促进了乳酸的增加,为进一步研究PGK1在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础.
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日本血吸虫SjPGK基因克隆和序列分析
目的克隆日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列.方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA 序列设计并合成一对引物,以日本血吸虫成虫总RNA为模板,采用逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR )特异性扩增SjPGK基因片段,将其克隆入pMD18-T载体中,经双酶切分析和PCR鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用BLAST程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较.结果 RT-PCR特异性扩增出一条长约830 bp的条带;重组质粒的双酶切和以其脱氧核糖核酸为模板的PCR均可见一条与RT-PCR产物相同的条带;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明:SjPGK基因片段长为 830 bp ,与 SmPGK 的核苷酸同源性为 85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473.结论成功地克隆了SjPGK 编码基因片段,为寻找日本血吸虫新的抗感染疫苗候选分子奠定基础.
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日本血吸虫pcDNA3.1(+)-SjPGK重组质粒的构建及鉴定
目的构建日本血吸虫中国大陆株磷酸甘油酸激酶基因片段(SjPGK)的真核表达重组质粒,寻找新的预防日本血吸虫病的候选疫苗分子.方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从日本血吸虫总RNA中体外扩增SjPGK基因片段;克隆入pMD18-T载体中,然后挑取阳性克隆经双酶切分析、PCR鉴定;亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,阳性克隆经鉴定后进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较. 结果RT-PCR特异性扩增出一条长约830 bp大小的条带;重组质粒pMD18-T-SjPGK和pcDNA3.1(+)-SjPGK经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段;脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明:SjPGK基因片段长为830 bp,与SmPGK的核苷酸同源性为85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473. 结论成功地构建pcDNA3.1(+)-SjPGK重组质粒,为构建其核酸疫苗提供了条件.
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华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因的分子表达、蛋白纯化与定性
目的 选取一个华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因进行克隆表达、纯化,并鉴定该重组蛋白的分子特性及潜在的诊断应用价值.方法 根据Genbank中华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因顺序(L 47982)设计引物,从华支睾吸虫成虫cDNA扩增特异性片段,与pTrcHis表达载体连接,重组质粒在大肠埃希菌DH5α中表达,使用亲合层析柱纯化重组蛋白.分别使用SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定重组蛋白的一般分子特性和抗原活性,以免疫组化染色法探讨该抗原在成虫组织内的分布.结果 重组质粒在大肠埃希菌中成功表达,亲合层析获得高纯度的磷酸甘油酸激酶融合蛋白(rCsPGK),分子量约4.7×104.Western blot显示该重组抗原与华支睾吸虫感染阳性血清有较好的结合反应.ELISA结果 显示,rCsPGK用于检测特异性抗体在数值上可区分阴阳性血清,受检阳性与混合阴性血清A值之比(P/N)为1.22～1.86,明显低于使用全虫粗抗原的P/N值(4.24～8.21).免疫组化显示,针对rCsPGK的抗体与成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵有明显的染色反应.结论 该研究用pTrcHis原核表达系统成功克隆和表达了华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶融合蛋白.使用亲合层析能获得高纯度、具有潜在诊断应用价值的rCsPGK抗原,但用于检测特异性抗体的敏感性低于全虫粗抗原.免疫组化表明,华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶可能主要分布在成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵等组织内.
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体外蒿甲醚伍用血红素对血吸虫磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶的影响
目的观察体外蒿甲醚与血红素伍用对日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(PGK)和丙酮酸激酶(PK)的影响.方法以4～5周龄的血吸虫,置于含蒿甲醚和/或血红素的培素液内培养24h后,测定虫体的PGK和PK酶活力.结果体外,蒿甲醚(50μmo1/L)或血红素(50μmo1/L)对血吸虫的PGK和PK酶活力无影响,但两者伍用可引起两种酶的活力明显下降.结论蒿甲醚对血吸虫PGK和PK的影响具有血红素依赖性.
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肺硬化性血管瘤整个病变的克隆性
目的:探讨肺硬化性血管瘤(PSH)整个病变的克隆性并阐明其本质.方法:利用激光显微切割技术获取22例女性肺PSH组织中多角形细胞和表面立方细胞构成的整个病变及病变周围正常肺组织,分别提取基因组DNA,通过基于女性体细胞构成组织内X染色体失活嵌合性和磷酸甘油酸激酶(PGK)基因位点的克隆性分析、观察PSH整个病变的克隆性.结果:22例肺PSH光镜下均表现为典型的组织病理学特征,即呈实性、乳头状、硬化性和出血性组织结构.病变主要由间质圆形或多角形细胞及被覆在乳头状结构表面的立方细胞所构成.克隆性检测结果表明有7例31.8%(7/22)显示PGK基因位点多态性.经Hpa Ⅱ酶切后,所有具有多态性的标本2个条带中有1个条带的密度明显减弱或消失,而另1个条带保留,证明其均为肿瘤性增生.结论:PSH是一种真性肿瘤,构成PSH的2种主要细胞起源于同一类型细胞.
