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基于3D打印的Ⅰ型胶原涂覆β-TCP骨组织工程支架研究
根据骨缺损形态构建个性化的组织工程支架在骨组织工程应用中有巨大需求.基于3D打印技术制备个性化的Ⅰ型胶原涂覆的β-磷酸三钙(β-TCP)骨支架.通过比较0/90°、0/60°、0/45°的填充角度,0.10、0.25、0.50 mg/mL涂覆胶原的浓度对β-TCP支架孔径、孔隙率、力学性能的影响,选定优填充角度为0/90°及佳涂覆胶原的浓度为0.50 mg/mL的β-TCP/胶原支架.所得支架能准确地再现设计的三维模型,具有多级孔结构,大孔平均直径为315 μm,微孔直径为3～5 μm,孔隙率为84％.β-TCP/胶原支架的抗压能力为(12.29±0.88) MPa,压缩弹性模量为(116.74±27.75) MPa,与成人松质骨相似.体外大鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)支架培养实验结果显示,涂覆胶原的支架具有更好的生物相容性,能有效促进mBMSCs的粘附增殖,β-TCP/胶原支架上细胞具有更高的碱性磷酸酶(ALP)活性和Collagen-Ⅰ、BSP相关成骨基因的表达.研究结果显示,3D打印制备的Ⅰ型胶原涂覆的β-TCP支架具有匹配的外形,良好可控的孔隙率,对mBMSCs有良好成骨活性,为骨组织支架在临床上应用提供新的技术.
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人骨髓间充质干细胞结合多孔β-TCP构建生物相容性人工骨
研究人骨髓间充质干细胞(HBMSCs)结合多孔β磷酸三钙(β-TCP)的生物相容性与体内成骨作用. 密度梯度离心结合差异贴壁法分离HBMSCs,常规扩增传代,相差显微镜形态学观察和流式细胞仪检测细胞表面标记CD13、CD29、HLA-2、CD34、CD45和HLA-DR;分别在成骨、成软骨和成脂肪细胞培养基中定向诱导分化,验证其多向分化能力.将HBMSCs在低压下载入多孔β-TCP立方块,形成MSCs/β-TCP复合物,电镜观察材料内部与细胞结合情况.继续成骨诱导培养2周后植入裸鼠背部皮下,于植入4周和8周后取出复合物做组织学检查.设非成骨诱导培养复合物为对照. 原代和传代细胞呈梭形外观,生长增殖能力良好;流式细胞仪检测间充质细胞来源表面标记物CD13、CD29,HLA-2阳性,造血细胞来源表面标记物CD34、CD45 和HLA-DR阴性;能成功高效定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞;细胞在β-TCP材料表面贴附、增殖良好;MSCs/β-TCP复合物植入皮下4周后即有少量新骨生成,至8周时更明显;对照组新骨生成量较少.本方法快速、高效分离扩增HBMSCs;HRMSCs与多孔可降解β-TCP材料生物相容性良好;二者结合能显著提高体内新骨生成,提示其可用于临床作为骨移植替代物,可提高骨移植修复骨缺损的疗效.
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β-TCP 修复骨质疏松性骨缺损的实验研究
目的：探索β-TCP修复骨质疏松性大鼠骨缺损的效果。方法取SD大鼠20只，先去卵巢建立骨质疏松模型，等饲养3个月保证骨质疏松模型成功后再建立双侧大鼠股骨干骺端缺损模型，将手术成功的骨质疏松性骨缺损模型随机均分为两组，β-TCP植入组于骨缺损处植入β-TCP，空白对照组不作任何处理。术后4，8w进行大体观察、X射线摄片、组织病理学观察，Micro-CT观察。结果术后4、8w，β-TCP 植入组：缺损区X射线影像有明显的骨组织生成，HE染色可见大量骨小梁和较多核深染的长梭形骨细胞，Micro-CT显示骨微观结构修复效果较好，且能明显增加股骨骨密度；空白对照组X射线骨组织生成较少，骨小梁或骨板结构较少，排列较紊乱，Micro-CT显示骨微观结构修复效果不够理想，股骨骨密度增加不明显。结论β-TCP可较好地修复骨质疏松性大鼠股骨干骺端缺损。
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β-TCP三维支架用于骨髓间充质干细胞原位冻存研究
目的:探索骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)三维扩增原位冻存策略实践性及其对传代迁徙和成骨分化能力的影响.方法:制备β-TCP三维支架,相对2D平板考察三维扩增细胞数,冻存后以CCK-8染色计数考察收获冻存效率,迁徙率,并以ALP染色考察总体成骨分化水平和比分化活力.结果:与2D平板相比,3D培养速率提升7倍,原位冻存细胞收获存活效率由传统消化吹打方式的55.9%提升为81.3%;冻存处理后其迁徙率传代效率下降无统计学意义(P>0.05),比ALP活性经冻存处理非但未下降,反而在迁徙传代支架上显著性提升.结论:利用β-TCP三维支架扩增、传代MSC并进行原位冻存不影响传代迁徙能力,对成骨分化水平反而有贡献作用,具有较好的科研及工业生产应用前景.
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复合血管内皮细胞的不同孔径磷酸钙陶瓷体内血管化的比较研究
目的:比较不同孔径多孔β-TCP材料复合血管内皮细胞后的体内血管化,探索孔隙大小对人工骨材料体内血管形成的作用.方法:血管内皮细胞与连通径均为100 μM,而孔径分别为200-300 μM和300～400 μM两种不同孔隙结构β-TCP材料复合后包埋入36只成年新西兰兔的腿部肌肉内,相同结构的空白β-TCP材料作对照,术后2、4、8周对材料进行组织学观察、免疫组织化学分析,计算新生血管密度.结果:复合血管内皮细胞的材料血管形成启动过程早于空白对照组,术后第4周血管管腔已基本成形,并基本稳定,至第8周开始血管充盈,微血管密度高于对照组(P＜0.05).而不同孔径的材料比较发现,不论是复合血管内皮细胞的材料还是空白材料,孔径300～400 μM的材料内新生血管密度显著显著高于孔径200-300 μM材料(P＜0.05).结论:材料孔隙较大的材料更有利于材料体内的血管化,而复合血管内皮细胞后,更加快了其血管化进程,这一研究结果提示材料孔隙间的连通是影响材料体内血管化的关键因素,该研究结论将为改善人工骨材料体内血管化的方法提供新的思路,同时也为骨移植材料的优结构的选择提供一定的借鉴.
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孔径及壳聚糖对多孔β-TCP中庆大霉素释放的影响
目的:观察不同孔径的多孔β-TCP分别复合庆大霉素及庆大霉素/壳聚糖后在体外庆大霉素的释放情况,研究多孔β-TCP孔径及壳聚糖对庆大霉素释放的影响.方法:利用冷冻干燥法使不同孔径的多孔β-TCP分别复合庆大霉素及庆大霉素/壳聚糖.比色法测定样本液内硫酸庆大霉素浓度,抑菌环实验测定样本液中庆大霉素的抗菌性.结果:(1)多孔β-TCP/庆大霉素中庆大霉素的释放时间分别为72h (187-300μm)、48h(300-375μm)、48h(375-500μm)、48h(500-750μm)、48h(750-830μm),孔径187-300μm组释放时间长.(2)多孔β-TCP/庆大霉素/壳聚糖样本中庆大霉素的释放时间分别为12d(187-300μm)、12d(300-375μm)、12d(375-500μm)、13d(500-750μm)、12d(750-830μm),较β-TCP/庆大霉素中时间长,且在500-750μm上作用显著.结论:(1)孔径对于庆大霉素释放具有一定的影响作用,187-300μm是延长多孔β-TCP/庆大霉素释放的适孔径(在187-830μm内),但是时间太短.(2)壳聚糖能够显著延长庆大霉素在β-TCP上的释放时间,而在500-750μm孔径上作用强.
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整体填充和颗粒填充β-TCP植骨材料对修复腔隙性骨缺损的影响
目的:探讨不同植骨方法对于β-TCP(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)植骨材料修复兔股骨腔隙性骨缺损的效果.方法:24只成年家兔,被随机分为整体填充组(12例)和颗粒填充组(12例).以膝关节外侧切口入路,在双侧股骨髁部制备6mm(直径)×10mm(深度)骨缺损,按照事先随机分组结果,分别进行整体填充植骨和颗粒填充植骨.分别于术后3至6周处死动物,取材标本进行生物力学分析,Micro-CT检测和组织学观察.结果:3周时,整体填充组的大抗压强度明显优于颗粒填充组(P＜0.05),而Micro-CT检测发现新生骨密度(tissue mineral density,TMD)和新生骨体积百分比(bone volume fraction,BV/TV)在两组间均无明显差异,组织学在两组均表现为少量新骨形成；6周时,两组之间的大抗压强度无明显差异,而Micro-CT检测显示颗粒填充组的TMD和BV/TV均优于整体填充组(P＜0.05),组织学上颗粒填充组较整体填充组可见较多的新骨形成.结论:整体填充组提供了更好的生物学强度,颗粒填充组更有利于诱导新骨形成,二者各有优点.
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脐带间充质干细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷体内外成骨能力的初步研究
目的:观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)和支架材料β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷复合的体内外成骨情况.方法:在体外构建hUCMSCs和β-TCP的复合物,将细胞以3×10 5/mL的浓度接种到支架材料上进行复合体构建,并进行电镜观察、特异性免疫荧光染色、MTT、ALP检测.将复合物植入裸鼠体内,进行成骨能力研究.实验分为3组,即植入单纯β-TCP支架组、植入体外成骨诱导2周的hUCMSCs和β-TCP复合物组、单纯植入体外成骨诱导2周的hUCMSCs组.植入后2个月取出标本,进行大体观察、X线片观察和组织学观察.采用SPSS16.0软件包对实验数据进行重复测量随机区组设计的方差分析.结果:hUCMSCs植入支架4h后,即可见细胞在支架上附着,1周后可见细胞在支架中大量增殖,β-TCP具有一定的骨诱导性.复合物植入裸鼠内2个月,hUCMSCs和β-TCP复合组X线密度高.HE染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组见不规则新骨和血管形成,单纯β-TCP组未见明显新骨和血管形成.Masson染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组见大量胶原形成,单纯β-TCP组未见明显胶原形成.VG染色显示,2个月后,hUCMSCs和β-TCP复合组孔隙中有大量类骨质及少量骨陷窝形成,单纯β-TCP组未见类骨质形成.结论:hUCMSCs和β-TCP具有良好的生物相容性,两者构建的复合物在植入裸鼠体内2个月时可见新骨及血管化形成.
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β-TCP作用T淋巴细胞后调控BMSCs成骨分化的研究
目的 体外探究β-TCP对T淋巴细胞的免疫调节作用,并研究该免疫调节作用对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响.方法 将不同浓度β-TCP浸提液与T淋巴细胞培养,采用CCK8法和台盼蓝染色法进行细胞活性检测.流式细胞技术和细胞共聚焦法检测β-TCP浸提液与磁珠分选的CD4+T细胞培养后Th17亚群分化.收取β-TCP浸提液与T淋巴细胞作用后的上清液,ELISA法检测上清液中白介素(IL)-17A分泌量.将上清液再培养小鼠BM-SCs,qRT-PCR法检测成骨分化相关基因碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)的表达,ALP染色、茜素红染色法检测BMSCs的成骨分化的效果,Western blot法检测ALP和OCN的蛋白表达水平.结果 6.25 ～ 50 mg/ml的β-TCP浸提液可诱导CD4+T淋巴细胞向Thl7亚群分化,且当浸提液的浓度为25 mg/ml时,其诱导Thl7亚群分化效果好,同时该组上清液中IL-17A诱导小鼠BMSCs的成骨分化效果明显,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 25 mg/ml的β-TCP浸提液能够诱导T淋巴细胞向Th17亚群方向分化,Thl7细胞分泌IL-17A介导BMSCs的成骨分化,为进一步的体内实验奠定基础.
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人工活性骨内部微细胞构建的实验研究
目的 探讨利用快速成型技术(RP)制作特定外形的多孔β磷酸三钙(β-TCP)构建人工活性骨进行骨缺损修复的可行性.方法 将24只新两兰大白兔制作右侧桡骨标准骨缺损不愈合模型,采用RP技术SL法制作具与兔桡骨缺损外形一致的多孔β-TCP支架,并该组大白兔分为2组,A组通过多孔β-TCP支架+真空冻干吸附技术复合BMP,构建人工活性骨;B组单纯采用多孔β-TCP支架,然后在槽形支架中植入自体松质骨,术后2、4、8、12周行影像学、组织学、成骨量、生物力学和骨密度的观测.结果 两组材料在植入后12周后,均出现牢固的骨连接,但A组在成骨量、骨密度及生物力学指标方面优于B组(P＜0.05).结论 利用RP技术进行人工活性骨的构建是可行,多孔β-TCP复合支架有利于提高体内新骨生成,达到临床修复的目的.
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两种接种密度骨髓基质干细胞复合β-TCP对兔腰椎横突间融合的效果
[目的]观察两种不同接种密度的骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs),在成骨诱导分化后复合β-TCP应用于兔腰椎横突间脊柱融合的术后融合效果.[方法]应用BMSCs/β-TCP复合体对随机分为两组(低密度接种组和高密度接种组)的实验兔进行腰椎横突间非去皮质骨脊柱融合术,观察两组动物术后大体腰椎融合率、影像学特征、骨矿含量(bone mineralization content,BMC),骨密度(bone mineralization density,BMD)和矿化组织体积(bone mineralization tissue volume,BMV)及组织形态学变化.[结果]与低密度接种组比较,高密度接种组术后融合率明显提高,可达到71.4%(P＜0.05).显微CT图像结果显示高密度接种组横突间不仅新骨形成量多,而且融合稳固,且其BMC、BMD和BMV及新骨生成率均高于低密度接种组(P＜0.05).[结论]使用接种密度为10×106 cells/ ml的人工骨具有较好的融合效果,融合率可达到71.4%,这一点为临床应用BMSCs复合生物材料体外构建人工骨应用于非去皮质骨脊柱后路融合有一定的指导意义.
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球形多孔支架材料体内血管化的量化分析
[目的] 研究球形多孔β-磷酸三钙(B-TCP)支架植入体内后的血管形成情况.[方法]选择成年新西兰兔30只,随机分为5组,每只兔植入一个球形B-TCP材料(直径2cm,孔径500～600 μm,内连接径110～120 μm),于术后1、2、4、8、12周取材进行组织学观察、定量分析血管长人情况.[结果] 术后1周未见新生血管.术后2周,支架外周见细小幼稚的血管.4周时,为血管化的第一个高峰,与2周比血管数量增加(P<0.05).8周时,血管数及直径增加,但无统计学意义(P>0.05).12周时,为第2次血管化高峰,见粗大成熟的血管,与其他时间比血管直径增大(P<0.05).[结论] 血管化分阶段进行,即早期数量的增加和后期质量的提高.材料的结构和降解特性影响血管化.
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骨组织工程材料β-磷酸三钙及其复合材料改性的研究进展
β-TCP具有良好的生物相容性和骨传导性,作为生物降解材料,已被广泛应用于各种骨缺损修复.然而,β-TCP单独使用时,尚存在降解速度与骨生长不匹配、缺乏骨诱导效应等急需改进的问题.本文综述了近十年国内外关于β-TCP及其复合材料改性的研究进展,并对骨组织工程材料β-TCP未来的研究方向予以了展望.
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多孔β-TCP 生物陶瓷制备工艺进展
主要阐述了β-TCP粉末制备方法,包括湿法,干法和水热法工艺方法;多孔β-TCP成型方法,主要有发泡工艺、添加造孔剂工艺,有机泡沫浸渍工艺、注凝成型和微球堆积法成型;多孔β-TCP牛物陶瓷的现存问题和发展趋势.
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三维打印β-TCP颌骨修复支架的生物学评价
目的:探讨三维打印β-磷酸三钙(β-Tricalcium Phosphate,β-TCP)颌骨修复支架的生物学特性及体内成骨作用.方法:采用自动注浆技术制作β-TCP支架,将前成骨细胞(MC35T3-E1)接种在支架上,扫描电镜(SEM)观察材料结构与细胞黏附,CCK-8法检测细胞增殖,ALP法检测碱性磷酸酶活性.将2种支架复合重组人骨形成蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)后植入大鼠体内,发泡法制作的β-TCP支架为对照组,6周后取材行组织学观察.结果:三维打印支架具有规则多孔的立体结构,适合细胞黏附,且增殖及分化能力均高于对照组(P＜0.05).组织学显示复合rhBMP-2后三维打印支架新骨生成量高于发泡法制作的β-TCP支架(P＜0.05).结论:三维打印TCP支架生物相容性良好,复合rhBMP-2后可异位成骨.
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β-磷酸三钙复合自体骨髓修复兔牙槽骨缺损区牙齿移动的实验研究
目的:对比观察在正畸力作用下,牙齿在β-磷酸三钙(β-TCP)复合自体骨髓和单纯β-TCP修复后的牙槽骨缺损区的移动情况.方法:选择新西兰大白兔6只,拔除双侧下颌第一磨牙,扩大牙槽窝,建立牙槽骨缺损实验动物模型.采用自身左右对照设计,采用完全随机化分组将一侧分为实验组,采用β-TCP复合自体骨髓修复牙槽骨缺损,另一侧为对照组,单纯使用β-TCP修复牙槽骨缺损.两组均覆盖BME-10X胶原膜.术后12周,以下前牙作支抗,每侧加力80 g,牵引双侧下颌第二磨牙向近中移动,加力8周后处死,测量牙齿移动距离,并通过影像学和组织学切片观察对比分析两组牙齿移动区域牙槽骨等牙周组织的变化.结果:术后12周,施以正畸力,第二磨牙可以在实验组和对照组牙槽骨缺损修复区正常移动.实验组移动距离为(1.99±0.11)mm,对照组移动距离为(2.80±0.19)mm,差异有统计学意义(P<0.05).结论:在正畸力作用下,牙齿可以在牙槽骨缺损修复区正常移动.
关键词： 牙槽骨缺损 β-TCP 自体骨髓 引导性骨组织再生技术 正畸牙齿移动 -
高性能多孔β-磷酸三钙生物陶瓷制备新工艺研究
开发了一个制备高性能多孔高纯β-磷酸三钙(β-TCP)陶瓷新工艺,采用湿法工艺,将自制高纯、超细(1～几μm)的高纯、超细CaCO3调和成浆料加入到分析纯磷酸配制成的一定浓度的磷酸溶液中反应,配料按Ca/P原子比为1.50.反应在搅拌和超声波震荡下进行,并在10 min内完成,制得组成为Ca3(PO4)2nH2O的TCP前驱体沉淀,该沉淀粒度细(0.8～几μm)而均匀,过滤性能优良,固液能快速分离.用3%PVA溶液作粘结剂,20～30目的柱状硬脂酸作成孔剂,经压模成型、干燥、在1170 ℃下煅烧制得高性能多孔β-TCP生物陶瓷.研究表明,CaCO3粒度对TCP前驱体粒度、β-TCP陶瓷的孔隙率、抗压强度以及溶解速度均有影响,根据临床应用需要可以通过选用不同CaCO3粒度及致孔剂形状大小来调节陶瓷的孔隙率、孔结构,以控制陶瓷强度和溶解速度.
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脂联素微球复合 PLGA/β-TCP 支架材料的制备及生物活性评价
目的：制备载脂联素缓释骨支架材料，并评价其体外生物学性能。方法：利用离子乳化交联法制备负载脂联素的壳聚糖微球，应用热致相分离法制备乳酸和乙醇酸共聚物／β-TCP 支架材料并在其中包覆载药微球。通过扫描电子显微镜、体外释放行为、检测材料浸提液对 MC3T3细胞凋亡和增殖作用等实验综合评价载药支架材料的性能及生物学活性。结果：微球直径均匀，载药支架孔径20～200μm 并相互穿通，载药率1．3％，包封率70．3％，在缓冲液中药物释放持续91 d。材料浸提液诱导细胞凋亡率与空白对照组相当，载药支架材料对成骨细胞的增殖有促进作用。结论：载脂联素缓释骨支架材料具有缓释效果并促进成骨细胞增殖。
关键词： 壳聚糖 微球 聚丙交酯-乙交酯(PLGA) β-TCP 脂联素(APN)
