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吲哚胺2,3-二氧化酶在人急性单核细胞白血病(M5)和急性淋巴细胞白血病细胞中的表达及其抑制剂1-甲基色氨酸的治疗作用
本研究旨在探讨吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)在白血病细胞中的表达和作用.应用间接免疫荧光染色光法检测人急性单核细胞白血病(M5)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的细胞内吲哚胺2,3-二氧化酶的表达情况,并以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞系L1210建立白血病小鼠模型以观察吲哚胺2,3-二氧化酶抑制剂1-甲基色氨酸是否具有抑制白血病细胞生长的作用.结果表明:M5和ALL的白血病细胞中吲哚胺2,3-二氧化酶阳性细胞率分别为29.4±11.2%和24.7±7.96%,而对照组的外周血单个核细胞中吲哚胺2,3-二氧化酶阳性细胞率仅为3±1.2%;两个白血病组与正常对照组在吲哚胺2,3-二氧化酶阳性细胞率方面的差异均有显著的统计学意义(P＜0.05),而M5与ALL组之间在吲哚胺2,3-二氧化酶阳性细胞率方面无显著性差异(P＞0.05);1-甲基色氨酸(1-MT)治疗的白血病小鼠与对照组比较,肿瘤消退,生存期延长(P＜0.05),部分治疗小鼠达到无病长期生存(注射肿瘤细胞后生存期超过3个月).结论:人急性单核细胞白血病(M5)和急性淋巴细胞白血病(ALL)的细胞均表达吲哚胺2,3-二氧化酶,1-甲基色氨酸对白血病小鼠有一定的治疗作用.
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急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2,3-双加氧酶介导免疫逃逸的实验研究
为了探讨急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)参与肿瘤免疫逃逸的机制,从23例急性髓性白血病患者获取骨髓细胞,采用免疫组织化学染色法和RT-PCR法检测白血病细胞IDO的表达;在有或无1-甲基色氨酸(1-MT)存在下,以白血病细胞为刺激细胞,外周T淋巴细胞为反应细胞建立单向混合淋巴细胞反应体系(MLR),利用MTT法检测T淋巴细胞增殖率,并以反相高效液相色谱法检测相应MLR体系上清液中的IDO活性.结果显示,在23例急性髓细胞白血病患者中17例患者的骨髓白血病细胞上有IDO的表达;白血病细胞上的IDO活性抑制MLR体系中T淋巴细胞的增殖.结论:白血病细胞表达的IDO活性能阻抑外周T淋巴细胞的增殖,它可能参与了肿瘤免疫逃逸.
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1-甲基色氨酸对荷肝癌小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用
目的 观察1-甲基色氨酸(1-MT)对荷肝癌小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用.方法 建立荷肝癌小鼠皮下移植瘤模型.实验分为hepG2组、空质粒组、吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)生理盐水组、IDO 5-氟尿嘧啶(5-FU)组、IDO 1-MT组、IDO 1-MT和5-FU联合处理组,每组各8只.观测各组小鼠成瘤情况肿瘤体积差异以及常规病理检查变化,并采用免疫组化法检测肿瘤组织内IDO表达情况.结果 与hepG2和空质粒生理盐水组比较,IDO生理盐水组肿瘤体积大、生长快(P＜0.05).与IDO生理盐水组比较,5-FU组、1-MT组和联合处理组肿瘤体积较小、重量减轻,其抑瘤率分别为86.54％、79.95％、94.46％,差异有统计学意义(P＜0.05).其中联合用药组效果好(P＜0.05),5-FU组与1-MT组两者间肿瘤体积变化无显著差异(P＞0.05).HE病理切片观察各处理组可见癌细胞密度减少,坏死区域增加.各处理组外周血甲胎蛋白(AFP)降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 IDO可促进肝癌细胞的生长,参与了肝癌细胞的免疫逃逸；1-MT对人肝癌小鼠皮下移植瘤生长具有抑制作用,与化疗药联合应用效果更好.
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1-甲基色氨酸对卵巢癌细胞耐药性的逆转
目的 通过2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂1-甲基色氨酸(MT-1)对耐药细胞的生物学特性监测,探讨MT-1是否可以逆转耐药卵巢癌细胞的耐药性.方法 将MT-1与耐药卵巢癌细胞株即SKOV3/CBP细胞株共培养后,用酶联免疫法检测细胞内IDO浓度,MTT法监测细胞耐药及细胞增殖速度,Matrigel小室检测细胞侵袭能力.结果 与未加入MT-1组相比,加入MT-1组SKOV3/CBP中IDO的表达明显降低且差异有统计学意义(P＜0.05);同时加入MT-1组SKOV3/CBP细胞的半数抑制浓度(IC50)及耐药指数(RI)均明显下降,且癌细胞的侵袭能力降低均较未加入组差异有统计学意义(P＜0.05),加入MT-1后对耐药细胞的增殖能力增加但较未加入组在各时间段差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MT-1降低耐药SKOV3/CBP中IDO的表达,降低耐药细胞的半增殖指数及细胞的侵袭能力从而逆转其耐药性,MT-1可作为卵巢癌耐药治疗的新手段.
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IDO通过整合素αvβ3调控子宫内膜间质细胞黏附能力
探讨吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)通过细胞外黏附分子整合素对子宫内膜间质细胞(ESC)与细胞外基质黏附能力的调控.收集非内异症患者健康内膜、内异症患者在位内膜及异位内膜样组织,体外分离、培养获得子宫内膜间质细胞,并鉴定细胞纯度;In-cell Western比较分析健康、在位和异位ESC中IDO的表达水平,以及脂多糖(LPS)和1-甲基色氨酸(1-MT)单独或联合作用对IDO表达的影响;黏附试验分析LPS和(或)1-MT对ESC与细胞外基质laminin、collagen、fibrinogen、fibronectin等黏附能力的影响;进一步应用流式细胞术分析LPS或/和1-MT对相应细胞外基质配体-整合素表达的调节.结果显示,IDO在子宫内膜异位症患者来源在位及异位ESC中高表达.炎症因子LPS可以促进ESC中IDO的表达,并通过上调整合素αvβ3增强ESC对细胞外基质collagen Ⅰ、collagen Ⅳ、fibrinogen、fibronectin的黏附.IDO特异性抑制剂1-MT可以抑制ESC表达IDO,并且可以逆转LPS诱导的整合素αvβ3表达及ESC黏附能力.
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抑制吲哚胺2,3-双加氧酶活性促进慢性粒细胞白血病源树突状细胞的功能
目的:研究吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)在慢性粒细胞性白血病源性树突状细胞(dendritic cells derived from chronic myeloid leukemia,CML-DCs)中的表达,及抑制IDO活性对CML-DCs免疫刺激功能的影响.方法:RT-PCR检测17例患者CML-DCs的IDO mRNA的表达情况,流式细胞仪检测CML-DCs免疫表型.在有或无IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyltroptophan,1-MT)作用下,分别以不成熟CML-DCs(imDCs)和成熟CML-DCs(mDCs)为刺激细胞,完全缓解期(complete remission,CR)CML患者外周T淋巴细胞为反应细胞建立混合淋巴细胞反应体系,ELISA法检测CML-DCs上清液IL-12水平,MTT法检测CML-DCs刺激自体T淋巴细胞的增殖能力.结果:随着CML-DCs的诱导分化和成熟,IDO mRNA表达逐渐上调;经TNF-α诱导的DCs免疫表型除CD1a外,CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达均明显上调(P<0.05),且上述分子的表达不受1-MT的影响.用1-MT抑制IDO活性后的imDCs和mDCs,其IL-12水平均明显增加(P<0.05,P<0.01),且激发自体T淋巴细胞增殖的能力也明显增强(P<0.05,P<0.01).结论:抑制IDO活性可提高CML-DCs的IL-12分泌水平,增强其对自体T细胞增殖的刺激能力,IDO对DCs的负性调节为白血病生物治疗提供了新的思路.
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人源有机阴离子转运多肽1B1和多药耐药相关蛋白2双转MDCKⅡ细胞株的构建及其功能验证
目的 构建人源有机阴离子转运多肽1B1 (human organic anion transporting polypeptide 1B1,hOATP1B1)和多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,hMRP2)双转MDCKⅡ细胞株,验证其功能,并应用其考察创新药物2,3-双加氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT)的转运特性.方法 采用基因工程手段获得hOATP1 B1和hMRP2表达真核载体pVITRO2-SLCO1 B1-ABCC2,转染MDCKⅡ细胞,通过遗传霉素G418筛选得到稳定表达的细胞株;通过Realtime PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜确认目的蛋白特异性;利用该双转模型考察普伐他汀(不同pH环境和不同底物浓度)和1-MT的转运.结果 经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明重组质粒构建成功;通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦显微镜证明经遗传霉素筛选的MDCK-OATP1 B1/MRP2细胞构建成功;pH=6.5时,普伐他汀在所构建双转细胞模型上转运佳;在0～500 μmol/L的浓度范围内,普伐他汀在该模型上的转运呈现浓度依赖性.1-MT在该细胞模型上无明显转运.结论 成功构建人源MDCK-OATP1 B1/MRP2双转细胞株,发现1-MT既不是OATP1B1蛋白也不是MRP2蛋白的底物,该细胞株可用于OATP1 B1/MRP2介导的外源性物质(如药物)和内源性物质(如胆红素)的转运研究.
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1-甲基色氨酸对大鼠脑缺血再灌注模型小胶质细胞活化的干预作用
目的 研究IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-methyltryptophan,1-MT)对大鼠脑缺血再灌注模型小胶质细胞活化的干预作用及相关炎症因子表达的影响.方法 SD大鼠分为假 手术组、模型组和1-MT组.使用大脑中动脉闭塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)构建缺血再灌注模型.对大鼠进行神经功能缺损评分,TTC法测定脑梗死体积,HE染色检测梗死区域的病理形态变化,免疫组化法检测梗死区域IBA-1和GFAP的表达,免疫荧光技术检测NeuN阳性细胞数,Western blot法检测组织中IL-1β、TNF-α、NF-KB的表达水平.体外培养BV2细胞,采用氧糖剥夺法(oxygen glucose deprivation,OGD)模拟缺血缺氧条件,设置对照组、模型组和1-MT组,Western blot法检测小胶质细胞标志物IBA-1、IL-1β、NF-κB以及TNF-α的表达水平.结果 1-MT可以显著改善MCAO大鼠的神经功能,缩小梗死面积,抑制小胶质细胞的活化和相关炎症因子的表达.细胞实验中,1-MT可以显著下调OGD-BV2细胞中IBA-1的表达水平和IL-1β、NF-κB、TNF-α的水平.结论 IDO抑制剂1-MT对于大鼠脑缺血再灌注模型有着很好的保护作用,其作用机制与小胶质细胞的活化抑制以及相关炎症因子的表达有关.
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吲哚胺2,3双加氧酶对肝癌细胞的作用
目的:用IDO以及色氨酸经IDO催化后分解生成的代谢产物(L-犬尿素、邻氨基苯甲酸、喹啉酸)作用于肝癌细胞,观察肝癌细胞的生长及凋亡的情况.方法:将IDO作用于肝癌细胞.用MTT法测定细胞的活力,并用IDO的抑制剂1-MT进行干预.观察各个代谢产物对肝癌细胞生长的影响,用流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率以及细胞坏死率的变化.结果:不同浓度的IDO作用于HepG2细胞具有明显的时间和剂量依赖性,IDO浓度在0.5 mmol/L和5 mmol/L时可以促进HepG2细胞的生长(P<0.05),加入1～MT后IDO的这一作用受到抑制.只有喹啉酸能发挥提高细胞坏死率和凋亡率,抑制肝癌细胞的作用.结论:IDO表现为促进肝癌细胞生长的作用,1-MT可以抑制这一作用.L-犬尿素、邻氨基苯甲酸能够促进HepG2细胞的生长.喹啉酸对HepG2细胞有抑制生长作用.
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外源性吲哚胺2,3-双加氧酶与肝癌的免疫耐受
目的:探讨吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)参与肝癌免疫逃逸的机制.方法:混合培养HepG2细胞和T淋巴细胞,在有或无外源性IDO存在下,用RT-PCR检测细胞中IDOmRNA的表达.流式细胞仪分析混合反应体系中HepG2细胞的凋亡率,MTT检测T淋巴细胞抗HepG2细胞的细胞毒活性.结果:混合反应体系中,HepG2细胞表达IDOmRNA的水平随着IDO浓度的增高而无明显变化;在对照组及实验组(IDO浓度分别为0.05,0.5,5 mmol/L)中.HepG2细胞的凋亡率分别为(3.48 4±0.34)%,(3.32 4±0.35)%,(3.46 4±0.40)%,(2.75 4±0.26)%,T淋巴细胞的细胞毒活性分别为(17.36 4±1.24)%.(17.30±0.52)%.(17.48 4±1.08)%,(15.74±0.79)%.结论:外源性IDO能抑制外周T淋巴细胞发挥抗肝癌免疫作用,它可能参与了肿瘤免疫耐受.
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口服吲哚胺特异抑制剂1-MT治疗Lewis移植性肿瘤的实验研究
目的 探讨吲哚胺(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)在Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)移植性肿瘤小鼠的肿瘤组织和肿瘤引流淋巴结(tumor draining lymph nodes,TDLNs)内的表达情况,观察IDO特异性抑制剂1-甲基色氨酸(1.methyl tryptophan,1-MT)对ILC移植性肿瘤小鼠的防治作用.方法 采用Western blot和免疫组化技术.分析IDO在移植性肿瘤小鼠肿瘤组织和TDLNs中的表达情况;实验分PBS对照组和1-MT治疗组,采用直接观察法与LDH释放试验检测1-MT对移植性肿瘤的发生、发展以及荷瘤宿主特异性细胞毒淋巴细胞(cytotoxic T lymphoeyte,CTL)反应的影响作用.结果 在LLC移植性肿瘤小鼠体内,主要是由肿瘤组织和TDLNs内的单核细胞表达IDO:实验组与PBS对照组比较,肿瘤的发生与发展延迟(P＜0.05);荷瘤宿主特异性CTL反应增强(P＜0.05).结论 口服1-MT可以通过特异性抑制IDO活性延迟移植性LLC的发生和发展.
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ISCOM 型白血病瘤苗联合1-甲基色氨酸免疫治疗荷瘤小鼠疗效观察
目的：探讨免疫刺激复合物（ISCOM ）型白血病肿瘤疫苗（简称瘤苗）联合1-甲基色氨酸对荷瘤小鼠的治疗作用。方法皂苷溶液中加入脂肪酶蛋白（1 mg／mL ）7℃反应12 h ，加入80μL 脂类混合物溶液和5 mL 皂苷溶液（1 mg／mL ）制备ISCOM 型白血病瘤苗。 C57BL／6小鼠分为模型组、ISCOM 型白血病瘤苗组、1-甲基色氨酸组和联用组（ISCOM 型白血病瘤苗＋1-甲基色氨酸），小鼠注射 FBL-3细胞建立白血病荷瘤小鼠模型，模型组给予等量生理盐水，其余各组接受对应药物治疗4周后，记录体质量，NK 细胞、Mφ细胞和细胞毒 T 淋巴细胞（CTL）细胞杀伤活性、血清 IL-10和 IL-12表达水平。结果联用组瘤质量低于1-甲基色氨酸组和 ISCOM 型白血病瘤苗组[（0．64±0．26）g vs ．（2．49±0．91）g ，P＜0．01；（0．64±0．26）g vs ．（1．28±0．73） g ，P＜0．05）]；联用组 M φ细胞杀伤活性显著高于1-甲基色氨酸组[（55．69±13．69）％ vs ．（69．47±14．79）％，P＜0．01）]；联用组NK 细胞杀伤活性显著高于1-甲基色氨酸组[（38．41±8．27）％ vs ．（67．22±12．74）％，P＜0．01]；联用组 CTL 细胞杀伤活性高于1-甲基色氨酸组和 ISCOM 型白血病瘤苗组[（43．77±8．89）％ vs ．（69．68±11．44）％，P ＜0．01；（58．87±9．45）％ vs ．（69．68±11．44）％，P＜0．05）]；联用组 IL-10均显著低于1-甲基色氨酸组、ISCOM 型白血病瘤苗组[（76．2±6．82）pg／L vs ．（98．3±13．4） pg／L ，P＜0．01；（76．2±6．82）pg／L vs ．（202．3±44．5）pg／L ，P＜0．01）]；联用组 IL-12高于1-甲基色氨酸组、ISCOM 型白血病瘤苗组[（381．2±47．3）pg／L vs ．（332．1±30．2）pg／L ，P ＜0．05；（381．2±47．3）pg／L vs ．（291．2±17．3）pg ／L ，P＜0．01）。结论ISCOM 白血病瘤苗联合1-甲基色氨酸具有较佳的抗瘤活性，其机制可能是通过介导 IL-10和 IL-12的表达。
