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小鼠胚胎AGM区永生化MSC样基质细胞的分离及其生物学特征
为了探讨小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质微环境对胚胎造血的作用,分离鉴定小鼠背主动脉(dorsal aorta,DA)来源间充质干细胞样基质细胞(mesenchymal stem cell like stromal cells,MSC like stromal cells)并研究其生长特性、表面标志和间质分化能力.取E11.5小鼠胚胎,分离获得DA区细胞,转染质粒pSV3neo-SV40,筛选具有G418抗性的阳性细胞,挑取成纤维样细胞,传代培养并检测其增殖能力,应用流式细胞术检测相关表面标志,诱导其向脂肪、成骨和成软骨细胞分化.结果表明:筛选获得的20个细胞克隆多为成纤维样细胞.mDAF3和mDAF18可在体外传代50代以上,稳定表达G418抗性,细胞倍增时间约为24小时,具有向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞分化的能力,流式细胞术检测结果显示其表达CD29、CD44、CD105、Sca-1,弱表达CD34,CD45和CD31.结论:永生化的mDAF3和mDAF18具有MSC的表型特征和分化功能,提示小鼠胚胎DA区可能存在MSC,小鼠胚胎DA区MSC样基质细胞可为研究基质微环境对胚胎造血发育的调控作用提供支持细胞.
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人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析
为了筛选在主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞中差异表达的基因,以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为"实验方",以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为"驱动方",建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库.进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选,并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析.结果表明: 在所构建的AGM抑制消减杂交文库中,经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700 bp的克隆有211个,阳性率高达76.4%.经过基因芯片筛选,挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示,在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中,4个为未知基因,14个为已知基因,其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程. 这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道. 结论筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础.
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VEGFA、VEGFC及其受体和angiopoietin-1/angiopoietin-2及其受体在人胚胎卵黄囊血岛、AGM区的表达
本研究观察VEGFA、VEGFC及其受体和angiopoietin-1、angiopoietin-2及其受体在发育第3-12周人胚胎卵黄囊血岛、主动脉-生殖腺-中肾(AGM)区的表达.在征得意外流产孕妇同意并签字后,收集其意外流产的受精龄第3-12周的人胚胎,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,HE和免疫组织化学染色,光镜观察.结果表明:第21-25天人胚卵黄囊血岛血管内皮细胞和造血细胞强表达VEGFA及其受体flt1和flk-1,VEGFC及其受体flt4,angiopoietin-2及其受体Tie-2蛋白;弱表达angiopoietin-1蛋白.背主动脉和中肾于发育第4周开始表达上述各种因子及其受体,免疫阳性反应物集中在大而圆、有核的造血细胞.阳性细胞的数量到第7周到达高峰.8周以后,阳性细胞数量显著减少,到12周几乎所有的血细胞为免疫阴性反应.生殖腺主要在第6-8周表达VEGFA,flt1,flt4,angiopoietin-1,angiopoietin-2和Tie-2蛋白,但不表达VEGFC和flk-1.在AGM区的血管内皮细胞未检测到上述各因子的表达.结论:人胚胎卵黄囊血岛造血细胞和内皮细胞以及背主动脉和中肾共表达多种与血管发生和血液发生相关的因子.人胚内造血发生于第4周.
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人AGM区基质细胞对脐血LTC-IC的支持作用
为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血长期培养启动细胞(LTC-IC)的造血支持作用,建立了人AGM区基质细胞与脐血CD34+细胞体外长期共培养体系.采用免疫磁珠方法分离人脐血CD34+细胞,接种于已制备好人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)饲养层的24孔板中共培养,同时设无饲养层组作为对照,分别于共培养5、6、7、8周时收获细胞行造血细胞集落培养,并采用极限稀释法(LDA)检测与人AGM区基质细胞共培养后的脐血CD34+细胞的LTC-IC含量.结果表明,无饲养层的对照组培养5周后不再产生造血细胞集落,而以hAGMS1-S5作为饲养层,共培养5周后造血细胞仍具有集落形成能力.hAGMS1-S5维持LTC-IC的作用组间比较有显著性差异(P＜0.05),其中以hAGMS3与S4组支持作用强.LDA检测结果显示,hAGMS3和S4维持LTC-IC的能力无显著性差异(P＞0.05);与hAGMS3和S4共培养14天后脐血CD34+细胞中的LTC-IC扩增,分别是达到(176±46)%、(187±52)%,S3和S4两组间比较无显著性差异(P＞0.05).结论:人AGM区基质细胞S1-S5对脐血LTC-IC具有维持作用,特别是hAGMS3和S4两株细胞对脐血LTC-IC具有更好的维持及扩增作用.
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内皮细胞特异性缺失PTEN基因对小鼠胚胎AGM区血液血管干细胞发育的影响
本研究探讨内皮细胞特异性缺失PTEN基因能否影响小鼠胚胎AGM区血液血管干细胞(hemangioblast)的发育.基于Cre/loxP系统,获得Tie2 CrePtenloxp/loxp和Tie2 CrePtenloxp/wt基因型小鼠胚胎.采用PCR方法进行基因型鉴定；分离E10-E10.5胚胎AGM区,用胶原酶消化成单细胞,在甲基纤维素半固体体系里进行BL-CFC(blast colony-forming cell)培养,4-5天后计数BL-CFC数目.将单个BL-CFC挑出进行扩增培养,悬浮细胞进行造血集落培养,贴壁细胞在Matrigel上进行体外成血管实验,鉴定其双向分化功能.结果表明:内皮细胞特异性缺失PTEN基因,小鼠胚胎AGM区BL-CFC数量下降；同时,BL-CFC的造血分化能力增强,但BL-CFC来源的内皮细胞体外成血管能力下降.结论:内皮细胞特异性缺失PTEN基因,可以在血液血管干细胞水平影响造血和内皮细胞的分化.
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组织培养用于小鼠胚胎AGM区造血发育的研究
本研究通过建立组织培养方法探讨小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾区(AGM)区造血发育规律.选取小鼠胚胎AGM区作为实验对象,体外组织培养2天后,应用集落形成实验观察髓系祖细胞的数量,应用体内移植考察CFU-S1l和造血干细胞的发育.结果表明:组织培养后的AGM区细胞仍然具有形成髓系集落的能力；每个胚胎期10.5天(E10.5) AGM区在致死剂量照射的成年小鼠脾脏中可形成10.8±3.5个CFU-S11.更重要的是,经组织培养的E10.5 - E11.5 AGM区能高比例(85.7％)、高嵌合[(51.12±21.17)％]、长期(＞4个月)重建受致死剂量照射的成年小鼠的造血系统,在受鼠的外周血、骨髓、脾脏、胸腺中均能检测到供体来源的淋系或髓系祖细胞嵌合.结论:应用本研究建立的组织培养体系可对正常或基因突变胚胎AGM区中的多种造血起始细胞(尤其是造血干/祖细胞)进行发育动力学研究.
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PDK1在内皮细胞向造血细胞转换中的作用研究
目的 研究磷酸肌醇依赖性激酶1 (PDK1)在内皮细胞向造血细胞转化阶段对造血干细胞(HSC)发生的影响.方法 应用Vec-Cre在内皮细胞中特异性敲除PDK1基因,取对照组PDK1fl/fl、PDK1fl/+小鼠及敲除组Vec-Cre;PDKIfl/fl小鼠胚胎的主动脉-性腺-中肾区(AGM区)细胞进行集落形成实验,检测PDK1基因对造血祖细胞功能的影响;取对照组和敲除组AGM区细胞行移植实验,检测PDK1对HSC功能的影响;取对照组和敲除组AGM区细胞,通过流式细胞术检测PDK1对能够向造血转化的CD31 +c-Kitugh细胞群比例、细胞周期及细胞凋亡的影响;分选对照组和敲除组AGM区CD31+c-Kithigh细胞群,通过Real-time PCR检测PDK1对内皮向造血转换相关的转录因子(RUNX1、P2-RUNX1、GATA2)的影响.结果 PDK1敲除后,造血祖细胞形成的克隆形态变小,数目减少[敲除组CFU-GM为(24±5)个/ee,对照组为(62±1)个/ee,P=0.001];破坏了造血干细胞重建造血及多向分化的能力(敲除组移植5只,0只重建,对照组移植7只,5只重建,P=0.001);AGM区CD31 +c-Kithigh比例降低[敲除组CD31+c-Kithigh曲比例为(0.145±0.017)％,对照组比例为(0.385±0.04)％,P=0.001];并且AGM区由内皮细胞向造血细胞转换的关键转录因子表达下降,但对CD31 +c-Kithigh细胞的增殖和凋亡无明显影响.结论 在内皮细胞中特异敲除PDK1基因,导致具有向造血转化的内皮细胞群比例降低,影响了HSC的发生,破坏了HSC重建造血的能力.
