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人胚AGM区造血干/祖细胞的分离及其在含AGM区基质细胞体系中的培养
本研究分离人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区遣血干/祖细胞(HSPC)并在含人AGM区基质细胞的培养体系中进行培养,以了解人AGM区基质细胞对HSPC的作用.以免疫组织化学方法检测人胎龄28-45天胚胎AGM区细胞CD34、Flk-1、VEGF的表达;分离AGM来源的HSPC,通过直接接种和经Transwell非直接接触两种方法接种于含人AGM区基质细胞系(hAGMS3和hAGMS4)饲养层的培养体系,观察HSPC生长情况和卵石区形成细胞(cobblestone area-forming cells,CAFC)并计数卵石区(cobblastone area,CA);用间接免疫荧光方法检测培养体系中悬浮细胞和CAFC的CD34、Flk-1表达;收获细胞进行半固体造血集落培养以检测两种培养方法对AGM-HSPC的集落形成能力影响.结果表明:人AGM区造血细胞表达CD34和Flk-1.两种接种方法均显示有CFC形成.直接接触培养能形成CD34和Flk-1双阳性的CAFC,集落总数明显高于非接触培养(hAGMS3体系:1 647±194 vs 389±31,P＜0.05;hAGMS4体系:1 586±75 vs 432±35,P＜0.05).结论:1人胚AGM区含有CD34+Flk-1+的HSC.2首次建立含人胚AGM基质细胞的AGM-HSPC培养体系,直接接触培养和非直接接触培养均能促进AGM-HSC的生长,AGM基质细胞与HSC直接接触发挥重要作用.
关键词： 永久造血 主动脉-性腺-中肾区 造血干细胞 基质细胞 卵石区形成细胞 -
BMP-4在人AGM区基质细胞的表达
本研究旨在观察BMP-4在人胚胎主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞的表达,为建立含AGM区基质细胞的诱导胚胎干细胞造血分化培养体系提供理论和实验依据.体外传代培养人胚胎AGM区基质细胞(hAGM S1-S5)及取自同期胚胎的躯干成纤维细胞(hFT),采用RT-PCR方法在mRNA水平分析BMP-4在hAGM S1-S5的表达情况,并应用ELISA方法测定BMP-4在hAGM S1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,同时以hFT细胞作为对照.结果表明:体外培养中的hAGM S1-S5细胞形态学表现主要为成纤维间质细胞样,少量呈内皮样,是早期胚胎AGM区来源的异质细胞群.hAGM S1-S5细胞均表达BMP-4 mRNA,hFT不表达BMP-4 mRNA.hAGMS1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的BMP-4,其分泌水平(pg/ml)分别为55.98±11.20、61.16±9.39、76.26±11.31、86.38±18.34、85.39±21.22,与hFT对照组(16.76±7.04 pg/ml)相比有显著性差异(p＜0.05),hAGM S1-S5组间比较BMP-4水平无显著性差异(p＞0.05).结论:体外培养中的人AGM区基质细胞表达BMP-4,与AGM区基质细胞支持造血干细胞原始发生的功能相关.
关键词： BMP-4 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 -
体外培养的人AGM区基质细胞表达多种造血生长因子
本研究检测人胚胎主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞表达的造血生长因子,为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料.采用RT-PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Flt3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)的表达情况,应用ELISA法测定IL-6、SCF、Flt3-L在hAGMS1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,并将脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用.结果表明:hAGMS1-S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA,不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA.在hAGMS1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Flt3-L、IL-5等因子,hAGMS1-S5组间比较各因子水平无显著性差异(P＞0.05).集落培养结果表明,hAGMS1-S5对CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用,hAGMS1-S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论:人AGM区基质细胞表达SCF、Flt3-L、IL-5、OSM等多种造血生长因子,这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 造血生长因子 -
含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用
为探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎千细胞(embryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14 ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Tran-swell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM + FL诱导和AGM + BM诱导共6组.分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+ c-Kit+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析.结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+ c-Kit+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.O1);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组佳(p<0.01).结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 胚胎干细胞 造血干细胞 -
小鼠胚胎AGM区Flk-1+细胞的造血特性
本研究旨在考察Flk-1分子在胚胎期10.5 d(E10.5)的主动脉-性腺-中肾区(AGM区)不同类型造血前体细胞的表达情况.通过流式细胞术分析发现低于10％的Flk-1+细胞与CD41、CD45/Ter1 19有共表达,继而分选出CD31+ CD45-Ter119-Flk-1+ CD41+(R1,代表不成熟的造血前体细胞)和CD31+CD45-Ter119-Hk-1+CD41-(R2,代表内皮细胞)两群细胞,利用造血集落培养和OP9共培养体系分别考察其体外的髓系与淋系潜能.结果表明:仅R1组细胞能在造血集落培养体系中形成典型的造血集落,但与OP9共培养7-9d后,两组细胞均能产生丰富的造血前体细胞(CD45+ c-Kit+)、髓系细胞(Gr-1+/Mac-1+)、红细胞(Ter119+)和B淋巴细胞(CD19+).结论:E10.5的小鼠胚胎AGM区Flk-1仍然在幼稚的造血前体细胞以及更早期的生血内皮细胞表达,但是此时的造血干细胞前体和造血干细胞是否表达Flk-1仍需通过体内功能实验明确.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 造血前体细胞 内皮细胞 淋巴细胞 Flk-1 -
造血干细胞联合AGM基质细胞移植对骨髓移植小鼠造血重建的影响
目的 探讨造血干细胞与主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区来源的基质细胞联合移植对同基因骨髓移植(bone marrow transplantatton,BMT)小鼠BMT后骨髓造血的影响.方法 建立同基因骨髓移植小鼠模型,随机分成4组:空白对照组、BMT组、BMT联合AGM基质细胞移植组(联合移植组)及川芎嗪组,另设正常组.分别于BMT后7、14、21和28 d检测外周血细胞、骨髓单个核细胞(bone marrow mono-nuclear cells,BMMNC),3、7、10、14、2l和28 d检测骨髓组织学变化.结果 联合移植组骨髓单个核细胞较川芎嗪组恢复快,联合移植组及川芎嗪组外周血血细胞、骨髓单个核细胞、骨髓组织恢复均较单纯BMT组快,差异有统计学意义.结论 BMT联合AGM基质细胞移植对骨髓移植造血重建具有促进作用.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 同基因骨髓移植 造血重建 造血微环境 -
人胚胎AGM区基质细胞在体外培养中对脐血CD34+细胞的支持作用
目的探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血CD34+细胞的造血支持作用.方法采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞,接种于底层已制备好的人AGM区基质细胞S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维(hFT)细胞为对照,体外培养28 d,每7 d收获细胞并检测总数,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38细胞含量,并行造血细胞集落培养.结果在未加外源性造血生长因子的条件下,5株人AGM区基质细胞hAGMS1～S5对造血细胞总数、CD34+及CD34+CD38细胞、造血细胞集落均有不同程度的扩增及维持作用,与无饲养层组、hFT细胞组比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞总数在21 d达到峰值[扩增(25.13±4.83)倍],CD34+、CD34+CD38-细胞在扩增14 d达到峰值[(2.68±0.51)倍、(2.38±0.45)倍],高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)亦在14 d达到峰值[(2.62±0.85)倍].hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论人AGM区基质细胞对脐血CD34+细胞具有维持及扩增作用,特别是hAGMS3、S4两株细胞具有更好的维持作用,为胚胎早期造血发生机制和诱导胚胎干细胞造血分化研究提供了重要的模式细胞和基础资料.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 造血干细胞 细胞培养 -
人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建
背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化.目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6 d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性.再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Co γ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组.结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%.NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成.静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21 d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因.提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 胚胎干细胞 造血干细胞 拟胚体 造血重建 -
含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化
背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞.目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件.方法:将小鼠E14 胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell 非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL 和EB/AGM+FL+BM共4 组.共培养6 d 后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态.结果与结论:①EB/AGM+FL 组和EB/AGM+FL+BM 组收获细胞涂片均发现原始造血细胞.②拟胚体来源细胞经AGM 区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+ 细胞明显升高(P < 0.05).③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P < 0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高.提示AGM+FL 和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 肝脏 骨髓 胚胎干细胞 造血干细胞 -
Notch1信号在小鼠胚胎早期造血发育阶段的表达
目的 探讨小鼠胚胎早期造血发育阶段Notch1信号的表达.方法 采用RT-PCR和Western blot法对小鼠胚胎9.5 d(E9.5)、E10.5、E11.5和E12.5的主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)区和胎肝中Notch1信号基因和蛋白的表达水平进行检测.结果 AGM区Notch1基因mRNA的表达量较高,且随孕龄的增大而递减；胎肝中Notch1基因mRNA的表达水平有明显的差异,其中E10.5表达量低,E11.5表达量高；在各个时相,AGM区与胎肝中Notch1基因mRNA的表达水平差异均有统计学意义(p＜0.05).Notch1蛋白与Notch1基因mRNA的表达规律相同,但除E9.5外,其他3个时相AGM区与胎肝中Notch1蛋白的表达水平差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 Notch1信号在造血祖细胞的发育分化中具有重要作用,规律是由AGM区向胎肝区迁移.
关键词： Notch1 主动脉-性腺-中肾区 胎肝 胚胎发育 -
造血发育过程中造血祖细胞生物学特性的时空变化
本实验以小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区、胎肝(fetal liver,FL)以及小鼠骨髓(bonemarrow,BM)为研究对象,研究各阶段造血祖细胞在发育过程中的c-kit的表达变化和部位迁移,以及不同发育阶段、不同造血部位来源c-kit+细胞的生物学特性.用流式细胞术检测小鼠胚胎10.5天(embryonic 10.5,E10.5)、E11.5的AGM区,E12.5、E14.5、E16.5、E18的FL以及BM来源的单个核细胞中c-kit+细胞的比例.用磁珠分选法分离E10.5 AGM区、E14.5 FL以及BM来源c-kit+细胞,贴壁培养法分离小鼠E14.5 FL基质细胞.建立体外Transwell共培养体系,比较不同来源的c-kit+细胞增殖、分化、迁移以及集落形成能力.流式细胞术检测发现:相对于BM,E10.5 AGM区和E12.5 FL中c-kit+细胞比例较高.进行体外培养,AGM区来源c-kit+细胞具有较强的增殖潜能,而FL、BM来源的c-kit+细胞在体外培养中更容易分化;AGM区和FL来源的c-kit+细胞比BM来源的c-kit+细胞在体外培养中具有更强的趋化迁移能力.集落形成能力方面,AGM区来源c-kit+细胞具有较强形成混合集落形成单位(CFU-Mix)的能力;FL、BM来源c-kit+细胞则能形成更多粒单系集落形成单位(CFU-GM).以上结果表明,和FL、BM来源的c-kit+细胞相比,AGM区来源c-kit+细胞具有更强的体外增殖、多系分化潜能以及趋化迁移能力,在未来可能有着更广阔的应用前景.
关键词： 造血祖细胞 造血发育 主动脉-性腺-中肾区 胎肝 骨髓 -
造血干细胞联合AGM基质细胞移植对骨髓移植小鼠造血重建的影响
目的探讨造血干细胞与主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)区来源的基质细胞联合移植对同基因骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)小鼠BMT后骨髓造血的影响.方法建立同基因骨髓移植小鼠模型,随机分成4组:空白对照组、BMT组、BMT联合AGM基质细胞移植组(联合移植组)及川芎嗪组,另设正常组.分别于BMT后第7、14、21、28d检测外周血细胞、骨髓单个核细胞(bone marrow mono-nuclear cells,BMMNC)、第3、7、10、14、21、28d检测骨髓组织学变化.结果联合移植组骨髓单个核细胞较川芎嗪组恢复快,联合移植组及川芎嗪组外周血血细胞、骨髓单个核细胞、骨髓组织恢复均较单纯BMT组快,有显著性差异.结论BMT联合AGM基质细胞移植对骨髓移植造血重建具有促进作用.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 同基因骨髓移植 造血重建 造血微环境 -
人AGM区基质细胞系的建立及其生物学特性
[目的]建立人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞系,研究其生长特性及表面标志的表达.[方法]取孕30～35 d的人胚胎分离培养AGM区基质细胞,传代培养成系并检测其增殖能力,应用流式细胞术、免疫荧光方法检测其造血相关表面标志和细胞外基质蛋白成分.[结果]人AGM区基质细胞呈成纤维样形态,指数生长期倍增时间约为16 h.流式细胞仪检测结果显示CD31、CD34、CD45在人AGM区基质细胞表面为阴性表达,而CD29、CD44、CD105、CD166均为阳性表达.免疫荧光检测结果显示AGM区基质细胞表达细胞外基质蛋白Tenascin、Fibronectin、Laminin及α-SMA.[结论]人AGM区基质细胞系呈现造血组织特异的相关分子表达特征,可以作为研究造血发生机理的模式细胞.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 基质细胞 造血发生 细胞黏合素 -
人AGM区基质细胞对脐血CD34+细胞形成HPP-CFU能力的支持作用
目的 探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血CD34+细胞形成高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)能力的支持作用.方法 采用免疫磁珠方法分离人脐血CD34+细胞,接种于底层已制备好人AGM区基质细胞S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维细胞hFT为对照,体外培养28天,每7天收获细胞行造血细胞集落培养.结果 5株人AGM区基质细胞hAGMS1～S5对HPP-CFU均有不同程度的扩增及维持作用,HPP-CFU在培养14天达到峰值,与无饲养层组、hFT组比较差异有统计学意义(P＜0.05).hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P＜0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5.结论 人AGM区基质细胞S1～S5对脐血CD34+细胞形成HPP-CFU的能力具有支持作用,特别是hAGNS3、S4两株细胞具有更好的造血干性维持作用,为胚胎早期造血发生机制研究提供了重要的模式细胞和基础资料.
关键词： 主动脉-性腺-中肾区 CD34+细胞 HPP-CFU
