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产甲胎蛋白的胃癌合并血栓栓塞一例
甲胎蛋白(AFP)是单链多肽,分子量为70kD,在人体生理条件下,AFP仅在卵黄囊的内胚层细胞和胎肝、新生肝细胞中大量合成,其次在胎胃肠道粘膜上皮细胞中也有合成,出生后含量很低.胃癌产生AFP较少见,仅占全部胃癌的1%～6%[1].
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小鼠胎肝Sca-1+细胞分化为骨骼肌细胞
探讨小鼠胚胎肝组织中干细胞抗原-1阳性的细胞(Sca-1+细胞)向骨骼肌细胞分化的潜能.取14.5d的小鼠胎肝,制作细胞悬液;用单克隆免疫磁珠细胞分离技术分离Sca-1+细胞;用PCR鉴别Y染色体性别决定区域(SRY)基因序列;将2×103个雄性小鼠Sca-1+细胞输注给经致死剂量(10Gy)60钴全身照射的雌性小鼠体内;于移植后2个月,处死受体小鼠,取骨骼肌组织固定、制片;用免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠骨骼肌组织内供体小鼠胎肝Sca-1+细胞向骨骼肌细胞分化情况.结果在骨骼肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,同时呈现骨骼肌组织的部分特征,表型为Dystrophin+/Flt-1-/CD45-F4/80-.提示小鼠胎肝Sca-1+细胞(其中绝大部分是造血干细胞)具有向骨骼肌组织细胞分化的潜能.
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P38-2G4蛋白在红系细胞分化过程中的动态表达分析
目的 分析小鼠P38-2G4蛋白在红系细胞分化中的表达及功能,初步研究该蛋白是否参与红系分化过程.方法 制备E10.5 ～E16.5胎肝细胞、FVA细胞及诱导剂丁酸钠和六亚甲基二乙酰胺诱导不同时间的小鼠红白血病细胞MEL,用Western blot检测P38-2G4蛋白在上述3种细胞中的表达,同时以联苯胺染色法检测细胞分化的标志蛋白血红蛋白的表达.结果 在不同分化期的胎肝细胞中,P38-2G4蛋白的表达先升高后降低;在FVA细胞分化过程中,P38-2G4表达量同样先增加后减少;而在诱导剂诱导MEL细胞分化过程中,P38-2G4表达量呈下降趋势.结论 P38-2G4蛋白在不同红系分化组织中的差异性表达提示该蛋白参与了小鼠红系细胞的分化过程.
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小鼠干细胞抗原阳性胎肝细胞在受体鼠脑组织中的分化
为了解胎肝干细胞是否具有向神经组织细胞分化的潜能,本研究采用免疫磁珠法分离雄性胎鼠肝组织中干细胞抗原-1(stem cell antigen, Sca-1)阳性细胞,尾静脉注射Sca-1+细胞(2.0×103个/小鼠)到经致死剂量(10.0Gy)放射线照射的10～12周C57BL/6J雌性小鼠.免疫组化和FISH双染色检测结果显示移植2、4、6月后受体雌鼠脑组织内存在大量Y染色体阳性细胞,约占脑组织总细胞为4.5%±0.5%,分布包括:侧脑室脉络膜丛、脑室室管膜、大脑白质灰质、小脑等.这些Y染色体阳性细胞表达神经组织细胞特异标志,如神经元特异核蛋白(Neuron-specific nuclei protein, NeuN)、神经纤维细丝蛋白M(neurofilament-160Ka,NF-M)、微管蛋白Ⅲ(tubulin Ⅲ,TuJ-1)、或者胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)等,其中Y染色体和NeuN均阳性的细胞为1.2%±0.3%、Y染色体和GFAP均阳性的细胞为1.0%±0.2%.这说明胎肝Sca-1+细胞能迁移进入脑组织,并且分化成神经细胞和星形胶质细胞.
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小鼠胎肝间充质干细胞的分离及鉴定
目的 分离培养小鼠胎肝间充质干细胞(flMSCs).方法 改良贴壁法分离BABL/c胎鼠肝脏间充质干细胞,测定生长曲线检测增殖能力;流式细胞术分析细胞周期和表型;体外诱导贴壁细胞向脂肪、软骨、骨组织分化并鉴定.结果 贴壁法分离的flMSCs呈均一梭形,细胞倍增时间约为24 h.83.76%±2.88%的flMSCs处于G0/G1期,表达间质系列表面标志CD44、CD29,不表达造血细胞表面标志CD45、CD11b;诱导后能向脂肪、软骨、骨组织方向分化.结论 贴壁法可以分离flMSCs,传代有助其纯化;flMSCs具有强增殖能力和分化潜能,是理想的干细胞治疗来源.
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人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析
为了筛选在主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞中差异表达的基因,以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为"实验方",以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为"驱动方",建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库.进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选,并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析.结果表明: 在所构建的AGM抑制消减杂交文库中,经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700 bp的克隆有211个,阳性率高达76.4%.经过基因芯片筛选,挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示,在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中,4个为未知基因,14个为已知基因,其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程. 这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道. 结论筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础.
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小鼠胎肝间充质干细胞移植治疗缺血性脑损伤的实验研究
目的:探讨小鼠胎肝间充质干细胞(flMSCs)移植对缺血性脑损伤是否具有修复治疗作用.方法:用快速PCR扩增Y染色体特异sry基因方法鉴定并分离BALB/c雄性小鼠flMSCs, 将其植入雌性缺血性脑损伤BALB/c小鼠损伤侧侧脑室.40d后观察神经功能,PCR检测脑组织sry基因;HE染色和尼氏染色观察脑组织结构;免疫组化和FISH双染观察flMSCs分化存活.结果:5只移植小鼠长期存活;移植后40 d,小鼠神经功能缺损有所改善;脑组织结构未见明显异常;移植小鼠脑组织sry基因阳性;(6.6±2.9)%的受体鼠损伤侧脑细胞Y染色体阳性,Y染色体和Nestin双阳性细胞占缺血侧脑组织细胞的(1.1±0.9)%.Y染色体和Tubulin双阳性细胞占(3.2±1.4)%,Y染色体和GFAP双阳性细胞占(0.9±0.7)%,对侧脑组织未见到染色体阳性细胞.结论:缺血性脑损伤条件下,小鼠flMSCs可以向神经细胞分化,参与损伤脑组织的结构重建.
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内皮祖细胞在慢性肾脏疾病患者心血管疾病发生中的新进展
以往研究认为内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)仅存在于胚胎发育阶段,之后的研究发现EPCs也存在于成体.目前的研究结果发现,EPCs主要来源于胚胎的中胚层和出生后的骨髓,是一群被发现的同时存在于胎肝、脐带血和成人外周血中、能够分化为内皮细胞的多潜能细胞,这群细胞具有修复损伤内皮细胞以及增强组织缺血后血管发生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)的作用.
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实时荧光定量PCR检测肝癌患者外周血甲胎蛋白mRNA水平
在生理状态下,甲胎蛋白(AFP)基因主要由胎肝细胞表达产生,出生后该基因表达迅速受到抑制.肝细胞大量坏死或发生原发性肝癌时,AFP基因再次激活[1].我们采用以Taqman技术为基础的实时荧光定量PCR技术,检测各型肝癌患者外周血细胞中AFP mRNA水平,分析外周血中是否存在肝癌细胞,并判断该方法检测肝癌细胞血液转移的可行性.
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人肝癌组织胰岛素样生长因子Ⅱ基因P4启动子甲基化变化及其意义
胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)是肝细胞产生的一种多功能调节因子,其基因含4个不同的启动子(P1～P4).在胎肝和新生儿肝,IGF-ⅡmRNA表达量高,其中P3活性大,其次分别为P4及P2,P1失活;在成人肝脏,IGF-ⅡmRNA水平显著下调,约为新生儿峰值的1/10,其中P1活性大,P2～P4活性明显降低或失活[1].近年发现,IGF-Ⅱ在人类肝脏的癌前病变及肝癌中呈过量表达[2,3],但其详细机制尚未明确.本研究探讨了肝癌组织中P4是否存在低甲基化及其与P4转录子表达变化的关系,旨在阐明IGF-ⅡP4启动子在肝细胞癌变中的作用及其临床病理意义.
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小鼠胎肝间充质干细胞在缺血脑组织中迁移机制的研究
目的:探讨小鼠胎肝间充质干细胞(flMSCS)在缺血脑组织中迁移的机制.方法:分离和培养小鼠flMSCS,制备小鼠脑缺血再灌注模型,RT-PCR方法检测小鼠flMSCS表达的趋化因子受体及其唯一配体基质细胞来源因子1α(SDF-1α)在缺血损伤脑组织中的mRNA表达;Western blot检测SDF-1α蛋白在缺血损伤脑组织中的表达;免疫组织化学检测SDF-1α在缺血损伤脑组织中的表达和分布;Boyden chamber法进行SDF-1α诱导flMSCS迁移的体外实验.结果:flMSCS经RT-PCR检测表达趋化因子受体CR1,CR3,CXCR1,CXCR2,CXCR3,CXCR4.脑缺血损伤侧脑组织SDF-1α mRNA表达显著增高,与正常脑组织SDF-1α mRNA比,具有显著差异(P＜0.01).Western blot检测显示缺血侧脑组织SDF-1α蛋白表达量在12、24、48 h分别为0.35±0.05,0.88±0.04,0.74±0.07,与正常脑组织SDF-1α蛋白(0.22±0.04)比,差异有显著性(P＜0.01).免疫组织化学检测显示,缺血损伤后24 h,缺血侧脑皮质,海马等缺血边缘区SDF-1α表达显著增高,缺血对侧及正常脑组织未见明显SDF-1α表达.体外迁移实验显示SDF-1α体外可以趋化flMSCS发生迁移,CXCR4阻断抗体可以阻断SDF-1α诱导flMSCS发生的迁移.结论:SDF-1α可以诱导flMSCS发生迁移,趋化因子受体CXCR4及其配体SDF-1α的相互作用是flMSCS在缺血损伤脑组织中迁移的机制之一.
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骨髓移植的进展及护理
骨髓移植(BMT)是指对病人实施免疫抑制预处理后,使机体失去排斥异体组织的能力,通过输注骨髓来重建造血功能的综合性治疗措施.由于骨髓中含有丰富造血细胞,因此,BMT是临床上常用的造血干细胞移植方法[1].造血干细胞移植包括BMT、胎肝造血细胞髓移植、外周血干细胞移植及脐带血造血细胞移植[2].BMT一词,一般是指同基因BMT和同种异基因BMT[3].
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传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较
目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法.方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行.①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准).冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5 mol/L乙二醇+体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液+0.1 mol/L蔗糖)两部分.②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞.胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20 min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5 min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察.③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20 min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5 min后迅速人液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1 h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察.④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组.⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况.结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P＜0.01).②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24 h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48 h.③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数＞10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P＜0.01).结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率.
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内皮祖细胞调控分子及机制研究进展
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是内皮细胞的前体细胞.Asahara等[1]于1997年首先从外周血中分离出CD34+/VEGFR2+的血管EPCs,它具有向内皮细胞分化的潜能.研究结果表明,EPCs是一群主要来源于胚胎发育阶段的中胚层和出生后的骨髓、主要存在于胎肝和脐带血以及成人骨髓和外周循环血中的、能够分化为内皮细胞的多潜能细胞[2].
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Notch1信号在小鼠胚胎早期造血发育阶段的表达
目的 探讨小鼠胚胎早期造血发育阶段Notch1信号的表达.方法 采用RT-PCR和Western blot法对小鼠胚胎9.5 d(E9.5)、E10.5、E11.5和E12.5的主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)区和胎肝中Notch1信号基因和蛋白的表达水平进行检测.结果 AGM区Notch1基因mRNA的表达量较高,且随孕龄的增大而递减；胎肝中Notch1基因mRNA的表达水平有明显的差异,其中E10.5表达量低,E11.5表达量高；在各个时相,AGM区与胎肝中Notch1基因mRNA的表达水平差异均有统计学意义(p＜0.05).Notch1蛋白与Notch1基因mRNA的表达规律相同,但除E9.5外,其他3个时相AGM区与胎肝中Notch1蛋白的表达水平差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 Notch1信号在造血祖细胞的发育分化中具有重要作用,规律是由AGM区向胎肝区迁移.
关键词： Notch1 主动脉-性腺-中肾区 胎肝 胚胎发育 -
NKX6.1协同PDX1诱导人胎肝间充质干细胞分化为胰岛B样细胞
目的 探讨NKX6.1对PDX1诱导人胎肝问充质干细胞(fetal liver-derived mesenchymal stem cells,FL-MSCs)向胰岛B细胞分化的协同作用及可能机制,以获取足够用于移植的胰岛B样细胞.方法 构建含PDX1与NKX6.1双基因的重组腺病毒载体,用该载体感染FL-MSCs并联合相应的细胞因子分步诱导,检测诱导后的细胞中PDX1和NKX6.1基因以及NGN3、NeuroD1/Beta2、MafA因子和胰岛素等多种胰腺B细胞相关分子的表达情况.结果 腺病毒载体转染24 h后FL-MSCs细胞即开始表达PDX1与NKX6.1基因,检测显示诱导后的细胞先后开始表达NGN3、NeuroD1和MafA等因子,持续稳定表达胰岛素等B细胞相关分子;且这些分子表达存在时序性.结论 PDX1与NKX6.1联合细胞因子在体外能有效诱导FL-MSCs分化为胰岛B样细胞;可能是通过先后活化的NGN3、NeuroD1和MafA等转录因子,限定细胞向内分泌前体细胞、进一步向B内分泌前体细胞、B细胞分化发育.
关键词： 胰腺十二指肠同源框1 Nkx6.1 胎肝 间充质干细胞 腺病毒载体 -
小鼠胎肝Sca-1+细胞分化为心肌细胞的研究
目的:探讨小鼠胎肝组织中干细胞抗原-1阳性的细胞(Sca-1+细胞)向心肌细胞分化的潜能.方法:取妊娠14.5 d的小鼠胎肝,制作细胞悬液,用单克隆免疫磁珠细胞分离技术分离Sca-1+细胞,PCR鉴别Y染色体性别决定区域(Sry)基因序列;将2×103个雄性小鼠Sca-1+细胞输注给经致死剂量50C0(10 Gy)全身照射的雌性小鼠体内,于移植后2个月,处死受体小鼠,取心肌组织固定、制片,免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠心肌组织内供体小鼠胎肝Sca-1+细胞向心肌细胞分化的情况.结果:在受体小鼠心肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,呈现心肌组织的部分特征,表型为Desmin+/Flt-1-/CD45-/F4-/80.结论:小鼠胎肝Sca-1+细胞(其中绝大部分是造血干细胞)具有向心肌组织细胞分化的潜能.
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体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究
目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.
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造血发育过程中造血祖细胞生物学特性的时空变化
本实验以小鼠胚胎主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区、胎肝(fetal liver,FL)以及小鼠骨髓(bonemarrow,BM)为研究对象,研究各阶段造血祖细胞在发育过程中的c-kit的表达变化和部位迁移,以及不同发育阶段、不同造血部位来源c-kit+细胞的生物学特性.用流式细胞术检测小鼠胚胎10.5天(embryonic 10.5,E10.5)、E11.5的AGM区,E12.5、E14.5、E16.5、E18的FL以及BM来源的单个核细胞中c-kit+细胞的比例.用磁珠分选法分离E10.5 AGM区、E14.5 FL以及BM来源c-kit+细胞,贴壁培养法分离小鼠E14.5 FL基质细胞.建立体外Transwell共培养体系,比较不同来源的c-kit+细胞增殖、分化、迁移以及集落形成能力.流式细胞术检测发现:相对于BM,E10.5 AGM区和E12.5 FL中c-kit+细胞比例较高.进行体外培养,AGM区来源c-kit+细胞具有较强的增殖潜能,而FL、BM来源的c-kit+细胞在体外培养中更容易分化;AGM区和FL来源的c-kit+细胞比BM来源的c-kit+细胞在体外培养中具有更强的趋化迁移能力.集落形成能力方面,AGM区来源c-kit+细胞具有较强形成混合集落形成单位(CFU-Mix)的能力;FL、BM来源c-kit+细胞则能形成更多粒单系集落形成单位(CFU-GM).以上结果表明,和FL、BM来源的c-kit+细胞相比,AGM区来源c-kit+细胞具有更强的体外增殖、多系分化潜能以及趋化迁移能力,在未来可能有着更广阔的应用前景.
关键词： 造血祖细胞 造血发育 主动脉-性腺-中肾区 胎肝 骨髓 -
肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂在类风湿关节炎中的作用研究进展
肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(FNF-likeweak inducer of apoptosis,TWEAK)作为肿瘤坏死因子超家族的新成员之一,初是从人扁桃体和胎肝cDNA文库中筛选出一条长1.3 kb,与肿瘤坏死因子(tumor necmsis factor,TNF)家族成员相似的cDNA,并将其命名为肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂[1].近年来的研究表明,抑制TWEAK途径可以使关节炎症和滑膜血管新生的明显下降,有效缓解类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的进展.本文从生物学功能、细胞因子、血管新生、骨再生几方面综述如下:
