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液相杂交检测B细胞淋巴瘤细胞系miR-28的表达
microRNA(而RNA)是一组在进化上高度保守、非编码蛋白、参与转录后调节的小分子RNA(19-25核苷酸).为了进一步明确miRNA的加工机制及功能和定量研究miRNA的表达水平,应用液相杂交和Northern blot两种方法检测miR-28在B细胞淋巴瘤细胞系中的表达并进行了比较.结果表明:液相杂交和Northern blot检测miR-28均显出阳性结果,但液相杂交所用的细胞总RNA量(5μg)明显少于Northern b1ot(30μg),液相杂交的条带信号也较Northern blot的强.结论:液相杂交是一种较Northern b1ot更为快速、简便和敏感的检测miR-28的方法.
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偏振荧光法定量测定细菌染色体的同源性
定量DNA-DNA杂交技术在细菌基因鉴定和分类方面发挥着重要作用,固相微孔板法,因其简便而被国内外微生物学工作者广泛应用[1-3].但因残留的多糖对DNA包板的影响,导致两种DNA杂交后同源性计算的误差,有碍细菌的鉴定和分类.液相杂交可避免这一不足.本研究应用一种新的荧光染料SYBR Green1特异性结合双股DNA的特性,并借助偏振荧光技术的敏感性,对10株临床分离菌进行了种间同源性测定,报告如下.
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人类疱疹病毒-8型和卡波肉瘤
卡波肉瘤(KS)是一种起源于血管的恶性肿瘤,其病因不清.流行病学提示,KS可能是被感染因子引起的.许多因子曾被提出,但没有一个被证实.直到1994年,Chang等证实一个从未报道过的病毒DNA片段存在于卡波肉瘤组织基因组中.这种新发现的病毒被命名为人类疱疹病毒-8型(HHV-8)[1].令人信服的血清流行病学及聚合酶链反应(PCR)资料提示HHV-8是感染源.为了探讨HHV-8与KS的关系,从6例KS石蜡切片中提取DNA,进行PCR和液相杂交.
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用于PCR产物检测的液相杂交法的优化
目的为了使液相交在检测更加灵敏、特异、快速.方法通过改进杂交液的成分,选择佳的探针浓度,使5'端标记生物素的PCR扩增产物与5'端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃10s冷却到37℃10s即完成杂交.杂交后产物通过链霉素亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测.结果液相杂交的条件优化:杂交液中DMSO浓度为300ml/L,探针浓度为0.5μmol/L,杂交温度为37℃.对60 bp～600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×104copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测 ,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性为100%(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性为100%(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性为78.6%(22/28);HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性为66.7%(16/24),其余为阴性.结论该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用.
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乙型肝炎病毒聚合酶链反应液相杂交酶免疫检测的定性判断值研究
目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶链反应(PCR)液相杂交酶免疫检测的定性判断值设立和灰区范围的计算方法. 方法以HBV为目的靶DNA, 引物P15'端标记Bio,PCR扩增35个循环.扩增产物与5'端标记Dig的探针混合进行液相杂交,杂交后产物被SA酶标板固定,经酶标记抗Dig抗体结合、显色. 结果实验结果显示,本试剂的检测敏感度在 3×104拷贝/ml.3种参比品A450值的95%、99%分布范围之间不存在交叉区,其中临界阳性参比品95%分布范围下限值(A450)为0.1 82.585例献血员血清标本的A450均值为0.037,P99上限值为 0.123,灰区范围在0.123～0.182.本试剂对"HBsAg+/HBeAg+/抗-HBc+”标本的阳性检出率为98.8%,"HBsAg+/抗-HBe+/抗-HBc+”标本的检出率为54.8%,阴性标本的检测有较高的特异性. 结论本试剂设立的定性判断值(灰区计算方法)具有很高的正确性、可操作性和临床实用性.
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改良PCR-ELISA的建立及初步应用
目的建立操作简单、灵敏、特异的PCR-ELISA.方法采用短DNA片段扩增,其中上游引物5′端标记有生物素,使PCR扩增产物的一条链上带有生物素,随着PCR反应的结束,P CR反应液中的地高辛标记的探针与PCR产物中的生物素标记的DNA链杂交,形成杂交产物,然后杂交产物通过生物素与微孔板上固定的链霉亲合素结合,被固定在微孔板上,后用ELIS A 检测被固定的杂交产物.结果该方法可以检测出1×101拷贝的HBV DNA 模板,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBSAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清100%(30/3 0)检出HBV DNA;HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清HBV DNA阳性为78.6%(22/28);HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清 HBV DNA阳性为66.7%(16/24),其余为阴性.非乙型肝炎血清的结果均为阴性. 结论该PCR-ELISA操作简单,方法灵敏、特异.
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慢性肾功能不全大鼠骨骼肌IGF-1及其受体的基因表达
探讨IGF-1及其受体在慢性肾功能不全(CRF)时骨骼肌蛋白质代谢中的作用.用放射免疫分析法检测CRF大鼠和与其配对喂养的假手术(SO)对照组大鼠血清和骨骼肌中IGF-1的含量;用液相杂交/RNase Protection Assay法观察骨骼肌中IGF-1和IGF-1受体的基因表达;用密度扫描法测定IGF-1 mRNA和IGF-1受体mRNA的水平;用配位结合置换试验测定IGF-1受体的数量;通过计算解离常数测定IGF-1受体的结合亲和力,以期发现CRF病人发生骨骼肌蛋白质营养不良、肌肉萎缩的原因.
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生物素标记探针-液相杂交-非变性PAGE检测非编码小RNA方法的建立和优化
目的 建立生物素标记探针-液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测非编码小RNA(sRNA)的方法.方法 将生物素标记的sRNA U6寡核苷酸探针经非变性PAGE电泳后转印至尼龙膜上,然后用辣根过氧化物酶(HRP)耦联链霉亲和素进行检测.从细胞中提取总RNA,用已标记U6探针优化液相杂交退火条件及杂交缓冲液;用建立的方法 检测并计算BEAS-2B、A549细胞中sRNA U6与miRNA145的含量.结果 将Biotin-11-dUTP成功标记至寡核苷酸上,随着寡核苷酸浓度增加,检测信号强度越强,10 μmol/L时达到强.采用水浴反应条件与采用聚合酶链反应(PCR)仪梯次降温反应条件下得到的杂化链无明显差异;以磷酸盐缓冲液作为杂交缓冲液优于Tris-HCl、DEPC水;BEAS-2B、A549细胞5 μg RNA中U6含量接近;BEAS-2B细胞中miRNA145绝对含量高于A549细胞.结论 成功建立并优化了sRNA检测新方法,为简单、易行、可靠地检测sRNA提供了可能.
关键词： 非编码小RNA 生物素化探针 液相杂交 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 -
运用荧光分光光度仪观测结核杆菌耐链霉素耐药rpsL 43密码子发夹探针液相杂交信号
目的 设计针对结核杆菌耐链霉素(SM)rpsL 43密码子的发夹型DNA探针,尝试运用荧光分光光度仪直接观测液相中发夹探针与rpsL 43密码子扩增产物杂交后荧光信号,从而检出该位点突变.方法 运用软件Beacon designer 设计针对rpsL 43密码子的发夹探针,应用荧光分光光度仪检测rpsL 43密码子扩增片段与探针杂交后荧光信号,并比较扩增产物测序结果.结果 通过荧光分光光度仪观测到结核杆菌标准株及SM耐药rpsL 43密码子扩增产物杂交荧光信号存在显著差异;20株SM耐药组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,SM耐药组rpsL 43密码子突变检出率为70%,测序法突变检出率为65%,发夹探针杂交法假阳性株1例(504S).结论 应用荧光分光光度仪直接观测发夹探针液相杂交荧光信号具有简单、灵敏等优特点;rpsL 43密码子点突变是重庆地区SM耐药的主要因素之一.
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乙型肝炎病毒的液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用探讨
目的 利用液相杂交技术,将核酸杂交技术进行简化,建立乙型肝炎病毒(HBV)的液相杂交的聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA)方法.方法 以HBV为目的靶DNA,引物P15'端标记Bio-PCR扩增37个循环.PCR扩增产物与5’端标记地高辛的探针呈液相混合,85cC 2.5 min,60C1 min进行杂交,杂交后产物均经过链霉素亲和素酶标板进行固定,经过酶标仪记录抗地高辛标记抗体,结合、显色.结果 液相杂交酶联免疫检测条件的优化:地高辛的探针浓度为2.4 pmol/次,液相杂交时间为2.5min,固相杂交时间为100 min,检测结果差异无统计学意义(P＞0.05)；本试剂对87份“HBsAg+、HbeAg+、抗HBc+”标本的阳性检出率为91.95％; 72例“HBsAg+、抗-Hbe+、抗HBc+”标本的阳性检出率为68.06％,其他免疫检测指标组合标本为16份.结论 HBV的液相杂交技术应用于聚合酶链反应酶联免疫检测(PCR-ELISA),该杂交技术的实验操作简便,快速,适合于临床实验室的检测.
