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维甲酸诱导HL-60细胞分化过程中WT1基因表达及其异构体比例变化的研究
目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化过程中WT1基因及其异构体表达水平及比例变化.方法 采用ATRA诱导HL-60细胞分化,以硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验及细胞免疫标记CD11b检测判断细胞分化程度;即时荧光定量RT-PCR方法检测HL-60细胞在诱导分化过程中总WT1、WT1(17AA+)及WT1(KTS+)的表达,并计算出WT1(+/+)、WT1(+/-)、WT1(-/+)、WT1(-/-)四种异构体的比例.结果 ATRA诱导HL-60细胞分化过程中NBT阳性率及CD11b表达阳性率与诱导分化前(0 h)相比均显著增加(P<0.05,P<0.001).随着细胞分化,WT1表达水平由0 h的(4.17±2.21)× 10~(-3)降低至96 h的(7.53±2.30)×10~(-4);17AA+和KTS+两类异构体的比例也逐渐下降,17AA+异构体比例由0 h的0.60±0.05降到96 h的0.42±0.08(P<0.05).KTS+异构体比例由0.53±0.08降至96 h的0.41±0.04(P<0.05);四种异构体的比例变化表现不一致,WT1(+/+)比例由0 h的0.32±0.06降至96 h的0.17±0.03,而WT1(-/-)比例由0 h的0.19±0.04升至96 h的0.34±0.05,另外两类异构体比例变化差异无统计学意义.结论 ATRA诱导HL-60细胞分化过程中总WT1表达水平逐渐降低,分化前异构体以WT1(+/+)为主,而分化后以WT1(-/-)为主,提示WT1基因可能通过调节四种异构体比例而发挥抑制或促进分化的作用.
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儿童肾母细胞瘤WT1基因突变四例报道
目的 研究儿童肾母细胞瘤患者WT1基因的突变类型及突变频率.方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增出54例儿童肾母细胞瘤患者WT1基因全部10个外显子及其相邻内含子序列,经纯化后进行PCR产物直接测序.结果 4例患者WT1基因分别存在3个杂合无义突变及1个纯合错义突变.例1患者WT1基因7号外显子第1006位碱基A→T杂合突变,造成第336号氨基酸由赖氨酸转变为终止密码子,即K336X.例2患者WT1基因9号外显子第1168位碱基c→T杂合突变,造成第390号氨基酸由精氨酸转变为终止密码子,即R390X.例3患者WT1基因6号外显子第814位碱基G→T杂合突变,造成第272号氨基酸由谷氨酸转变为终止密码子,即E272X.例4患者WT1基因10号外显子第1228位碱基A→G纯合突变,造成第410号氨基酸由丝氨酸转变为甘氨酸,即S410G.结论 散发的中国儿童肾母细胞瘤患者WT1基因外显子突变的发生率与国外报道相近,检测到的4例突变患者中3例为无义突变、1例为错义突变.
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WT1基因变异相关肾脏病临床、病理特点与基因变异类型的临床研究
目的 探讨WT1变异相关肾病临床、病理特点与基因变异类型的关系.方法 回顾性分析2009年1月—2018年5月南方医科大学南方医院、中山大学孙逸仙纪念医院、中山大学附属第一医院儿科新诊治及既往诊治的WT1变异相关肾脏病患儿的临床和病理特点,与WT1基因变异的相关性.结果 共诊治WT1变异相关肾脏病患儿20例(新诊治5例),男6例,女14例.(1)Denys-Drash综合征10例:发现蛋白尿的中位年龄为1岁7月龄.弥漫系膜硬化3例,微小病变4例,局灶节段肾小球硬化(FSGS)1例,2例无病理.2例见肾小球基底膜(GBM)显著弥漫增厚.钙神经素抑制剂(CNIs)治疗5例,3例完全缓解,2例部分缓解.8例肾功能仍正常.基因检查结果WT1错义变异6例,无义变异3例,移码变异1例.(2)Frasier综合征(FS)2例:发现蛋白尿的年龄分别为1岁1月龄和1岁9月龄;均为FSGS,GBM分层.分别在1岁6月龄和6岁6月龄进入终末期肾脏病(ESRD).CNIs治疗1例,蛋白尿部分缓解.均为WT1基因剪切变异.(3)孤立性肾病8例:3例为剪切变异,其中1例5月龄发病已进入ESRD,FSGS 1例,微小病变1例,均见GBM分层;CNIs治疗,1例部分缓解,肾功能正常,1例无效,6岁9月龄进入ESRD.5例为错义变异;3例病理为弥漫系膜硬化的患儿,2例在6月龄即进入ESRD,1例9岁进入ESRD.结论 Denys-Drash综合征病情进展慢.WT1基因变异相关肾病基因变异类型中错义变异为11/20,剪切变异为5/20,其中剪切变异相关肾病起病早、进展快,可见GBM分层.CNIs治疗有效降低尿蛋白(8/9).
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Denys-Drash综合征三例临床病理特点
目的 探讨Denys-Drash综合征(DDS)的临床病理特征,以加深对DDS的认识.方法 总结2009至2011年诊治3例DDS患儿的临床病理特点和WT1检测结果,并结合文献复习.结果 3例DDS,例1、例2为核型46 XX、外生殖器正常女性,例3为男性伴双侧腹股沟隐睾.肾病起病年龄分别为1岁9个月、2岁4个月及3个月.例2、例3激素治疗无效.例1使用他克莫司,血浆白蛋白、胆固醇有改善,尿蛋白无缓解.例2用环孢素A、他克莫司蛋白尿均能缓解;现4岁9个月,蛋白尿缓解,肾功能正常.3例均是右肾单侧Wilms瘤,残肾病理均为弥漫系膜硬化.WT1检测:例1为外显子9的c.1213 C＞G错义突变,为新突变;例2、例3分别为c.1168 C ＞T无义突变和c.1130 A＞T错义突变.结论 DDS肾病临床表现变化较大,起病多较早,肾衰竭常在4岁以前出现,少数起病及肾衰竭出现较晚.其蛋白尿对激素治疗无效,但对钙神经素抑制剂环孢素A有效;本研究2例患儿使用他克莫司亦有效.DDS多因WT1突变所致,肾脏病理主要为弥漫系膜硬化.
关键词： Denys-Drash综合征 病理学 临床 WT1蛋白质类 弥漫系膜硬化 -
NB4细胞诱导分化过程中WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的研究
目的探讨WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的改变与NB4细胞诱导分化的关系.方法建立了实时定量RT-PCR方法检测看家基因GAPDH、WT1基因及其WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平,以同一份标本(WT1拷贝数/GAPDH拷贝数)×104来计算WT1表达水平,定义为WT1N(normalized WT1 expressionlevel),同样定义WT1(17AA+)N,并用流式细胞仪检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化.结果随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因及其WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平迅速下降,全反式维甲酸(ATRA)作用0,6,12,18,24,48,72 h后WT1N的平均表达水平分别为191.11,121.17,66.72,43.47,18.29,4.04和3.79,WT1(17AA+)N剪接变异体的表达水平分别为105.12,46.89,20.50,10.38,8.85,2.16和1.92,两者均与CD11b的变化呈负相关(r=-0.65,P＜0.01;r=-0.77,P＜0.01),而且值得注意的是在AT-RA作用后开始的18 h内,WT1(17AA+)N/WT1N比值逐渐下降,24 h后与药物作用前水平无统计学差异,表明在ATRA诱导NB4细胞分化早期以WT1(17AA+)剪接变异体表达下降为主.结论WTl基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关,WT1(17AA+)剪接变异体可能在分化阻滞中起主要作用.
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急性髓性白血病骨髓细胞NF-κB活性及其与WT1和Bcl-2表达的关系
目的探讨核因子κappa B(NF-κB)的活性在急性白血病发病及疗效中的意义及其与Wilms肿瘤基因(WT1)、B细胞淋巴瘤基因(Bcl-2)表达的关系.方法用EMSA方法检测43例急性髓性白血病病人(分初治、难治及完全缓解组)和30例对照骨髓细胞中NF-κB的活性,用RT-PCR方法检测了各组病人骨髓细胞中WT1、Bcl-2基因的mRNA表达水平.结果急性白血病难治组NF-κB活化明显高于初治组,初治组又明显高于完全缓解组,差异有统计学意义;对照组未检测到NF-κB活化; NF-κB活性与WT1、Bcl-2的表达水平两两之间均呈正相关(r＝0.909,P＜0.01;r＝0.494,P＝0.037).结论 NF-κB的活性及WT1、Bcl-2的表达水平与急性白血病的发病及疗效有关.难治性白血病疗效差可能与NF-κB的活性及WT1、Bcl-2的表达水平增高有关.
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依那普利和限食对肥胖相关肾病大鼠足细胞损伤的干预作用
目的 观察肥胖相关肾病(ORG)大鼠肾小球足细胞WT1表达,探讨依那普利和限食对ORG肾脏保护机制.方法 高脂饲料喂养Wistar大鼠24周建立ORG模型后,分为对照组(A)、模型组(B)、依那普利治疗组(C)、限食组(D)、限食加依那普利组(E)继续饲喂8周,观察24 h尿白蛋白(24 hUA1b)、肾组织形态学及超微结构,免疫组化检测足细胞WT1表达(足细胞密度).结果 B组足细胞数和密度显著低于A组(P<0.01),24 hUA1b和肾小球硬化显著高于A组(P<0.01);C、D、E治疗组足细胞教和密度明显高于B组(P<0.05,P<0.01),24 hUA1b和肾小球硬化较B组明显降低(P<0.01),且E组联合疗效明显优于单个治疗组.结论 ORG足细胞改变与蛋白尿程度和肾损伤呈一定相关性.依那普利加限食能明显抑制ORG足细胞WT1表达,减少尿蛋白.减轻肾损伤.
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nephrin、血管内皮生长因子及其受体表达与先兆子痫大鼠蛋白尿的关系
目的 研究nephrin、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)在先兆子痫大鼠肾组织的表达与蛋白尿的关系.方法 采用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)制备大鼠先兆子痫模型(n=8),分别与正常雌性组(n=6)、正常妊娠组(n=8)、未孕L-NAME对照组(n=6)大鼠比较动脉收缩压(SBP)、尿蛋白量(24 h).各组大鼠肾组织分别行光镜和电镜检查.Western印迹法、实时定量PCR检测nephrin在各组大鼠肾脏局部的表达;免疫荧光法检测各组大鼠肾小球内wilms肿瘤蛋白WT1的表达.Western印迹法检测VEGF及VEGFR(Flt-l、Flk-1)在各组大鼠肾脏局部的表达.结果 先兆子痫模型组大鼠nephrin蛋白的表达(0.0726±0.0074)显著低于正常雌性组(0.3795±0.0509)、正常妊娠组(0.2361±0.0437)及未孕L-NAME对照组大鼠(0.7265+0.0503)(均P＜0.01);而nephrin mRNA在各组大鼠间差异无统计学意义.各组大鼠足细胞数目差异无统计学意义.先兆子痫大鼠组VEGF的表达(1.5429±0.0898)显著高于正常雌性组(1.1870±0.1160)、正常妊娠组(1.3741±0.1165)、未孕L-NAME对照组大鼠(1.0155±0.0742)(均P＜0.01);先兆子痫组大鼠VEGFR(Flt-1、Flk-1)的表达均显著高于其他各对照组大鼠(均P＜0.05).结论 先兆子痫大鼠中,nephrin蛋白水平表达明显降低,肾脏局部VEGF-VEGFR表达显著增强,可能参与了先兆子痫蛋白尿的生成,其具体机制有待进一步研究.
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宫内生长迟缓引起大鼠肾单位数目减少的机制研究
目的 探讨宫内生长迟缓(IUGR)引起肾单位数目减少的机制.方法 采用孕期全程低蛋白(6%蛋白)营养建立IUGR大鼠模型.选取IUGR新生雄鼠作为研究对象,采用Ki-67免疫染色和TUNEL法检测肾组织细胞的增殖和凋亡;实时定量PCR测定肾组织WT1、Bcl-2、Bax及p53的mRNA表达水平;免疫组织化学法及Western印迹法检测肾组织中WT1和Bcl-2蛋白质表达.2周龄时测定肾单位数目.结果 2周龄时,IGUR大鼠肾单位数目明显少于对照组(P＜0.01).与对照组相比,IUGR新生鼠生肾区TUNEL阳性细胞数明显增多;肾脏WT1、Bcl-2 mRNA表达减少,Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比例降低,而p53 mRNA的表达差异无统计学意义;肾组织中WT1和Bcl-2蛋白质的表达量及在生肾区的分布也明显减少.结论 IUGR大鼠.肾单位数目减少可能与肾发生中细胞凋亡增加相关,而WT1、Bcl-2表达减少,Bcl-2/Bax比例降低可能是细胞凋亡增加的分子机制之一.
