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SHP2和MKP5在P2Y嘌呤受体介导的人前列腺癌细胞侵袭中的调控机制研究
目的探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶(SHP2)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5(MKP5)在P2Y嘌呤受体激活人不同转移潜能的前列腺癌细胞系MAPKs信号通路中的调节机制及其与细胞侵袭能力的相关性.方法构建野生型和突变型SHP2及野生型MKP5表达质粒并分别稳定转染入1E8(高转移)和(或)2B4(不转移)细胞.应用免疫沉淀法检测细胞SHP2的酪氨酸磷酸化的程度,免疫印迹法检测ERK1/2 、p38 的磷酸化,用Matrigel穿膜实验检测细胞的体外侵袭能力.结果 ATP可刺激细胞的SHP2发生磷酸化,且在1E8中的激活程度高于2B4.野生型SHP2转染可使2B4细胞中ATP 对 ERK1/2 的激活时效明显延长;而突变型SHP2延迟并降低1E8细胞中ATP对ERK1/2的激活水平;两者对细胞p38的活性均无明显影响.ATP刺激可使不转移 2B4细胞穿膜数明显增多(比对照组增加72.2%±14.0%),野生型SHP2转染可使经ATP刺激的细胞穿膜数进一步增加18.7%.ATP刺激可使高转移1E8细胞穿膜数进一步增加(112.8%±32.0%),而转染突变型SHP2可部分(40.9%)抑制ATP的促细胞侵袭作用.转染野生型 MKP5 在明显抑制p38磷酸化的同时,也能部分抑制 ATP 的促侵袭作用(抑制率在1E8和2B4分别为22.4%和28.7%).结论 SHP2正性调节P2Y嘌呤受体介导的ERK活化,并可促进前列腺癌细胞的侵袭能力.而MKP5通过抑制P2Y嘌呤受体介导的p38活化并降低细胞的侵袭能力.SHP2和MKP5 可以针对MAPKs的不同靶点对前列腺癌细胞的侵袭发挥不同的调控功能.
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类风湿关节炎患者蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22基因多态性的研究
目的 探讨蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(the protein tyrosine phosphatage nonreceptor 22,PTPN22)基因1123G＞C(rs2488457)单核苷酸多态性(SNP)与类风湿关节炎(RA)的关系.方法 采用实时荧光定量PCR对200例RA患者,100例其他风湿病患者,200名健康体检者PTPN22基因进行分型.用SPSS 11.0软件进行统计学分析和行×列表X2检验.结果 RA组PTPN22 CC基因型频率(0.120)与其他风湿病组(0.020)及健康对照组(0.015)比较差异有统计学意义(X2 值分别为18.708和24.337,P均＜0.01),而其他风湿病组与健康对照组比较,差异无统计学意义(X2值为1.066,P＞0.05);RA组C等位基因频率(0.360)明显高于其他风湿病组(0.190)及健康对照组(0.215),且差异有统计学意义(P＜.005).结论 PTPN22基因可能是RA的易感基因和RA等自身免疫病治疗的靶基因之一.
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蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体放射配体检测法的建立与临床应用
目的建立蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(IA-2A)的放射配体测定法. 方法经试管内转录与翻译,获得35S 标记的重组人IA-2抗原.35S-IA-2与血清在自制旋转孵育器上混匀过夜,用蛋白A-琼脂糖沉淀抗原抗体复合物.沉淀复合物经TBST缓冲液洗涤后,置液体闪烁计数仪计数,结果以IA-2A指数表示.并检测国人111例1型和113例2型糖尿病患者,以及125名健康志愿者的IA-2A水平,评价其敏感性、特异性及临床应用价值. 结果该方法的批内变异系数(CV)3.2%～9.7%,批间CV 5.6%～11.7%;DASP 2003回报结果显示其敏感性64%,特异性100%;该方法检测45份标本的IA-2A指数与国际标准化实验室结果呈显著正相关(r=0.690,P＜0.01),且阴、阳性判断完全一致; IA-2A指数阳性阈值0.0065(为125名健康者的99.5%百分位点上限);该方法检测国人1型糖尿病患者阳性率23.4%(26/111),其中病程＜1年的阳性率33.3%(17/51),病程≥1年的阳性率15.0%(9/60),差异有显著意义(χ2=5.17,P＜0.05).2型糖尿病患者阳性率1.8%(2/113), 显著低于1型糖尿病患者(χ2=24.0,P＜0.001). 结论建立的IA-2A放射配体检测法灵敏、特异性和重复性好,可望广泛临床应用.
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抑癌基因PTEN与心血管疾病研究进展
1997年Li等[1]在浸润性乳腺癌的两个移植瘤中发现了10q23染色体特定区域的杂合子丢失,并通过外显子俘获分析法分离出一种新的基因,对其开放性阅读框序列分析,揭示了它可编码蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phospha-tase,PTP),且与张力蛋白(tensin)、辅助蛋白(auxilin)同源,因此将其命名为PTEN(phosphatase and tensin homology dele-ted on chromosome ten).FTEN是人类发现的第一个具有磷酸化酶功能的抑癌基因,在细胞的生长发育、凋亡、迁移、信号传递等方面起着重要的调控作用,PTEN功能的缺失与肿瘤的发生密切相关.近来,国内外陆续展开对PTEN与心血管疾病关系的研究报道,下面就PTEN的结构、功能及其与心血管疾病的关系等作一综述.
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T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶和内皮脂酶基因多态性与出血性脑卒中的相关性研究
目的 探讨当地汉族人群T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPN2)基因rs2847281和内皮脂酶(LIPG)基因rs2000813单核苷酸多态性与出血性脑卒中的相关性.方法 采用病例对照研究方法,收集出血性脑卒中患者264例(出血性脑卒中组),健康体检者390例(对照组),采用sequenom飞行时间质谱平台进行单核苷酸多态性基因分型检测,分析2组等位基因和基因型分布频率的差异,并且按照性别进行分层分析.结果 出血性脑卒中组与对照组rs2000813等位基因和基因型分布频率比较差异无统计学意义(P＞0.05).2组rs2000813在男性和女性中的等位基因和基因型分布频率比较差异无统计学意义(P＞0.05).2组rs2847281在女性中的等位基因分布频率比较差异有统计学意义,C等位基因是出血性脑卒中的保护因素(OR=0.590,95％CI:0.356～0.979,P=0.040):2组rs2847281在男性中的等位基因和基因型分布频率比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 rs2000813位点多态性与出血性脑卒中易感无关.rs2847281位点多态性与出血性脑卒中的相关性存在性别特异性:与女性出血性脑卒中易感相关,C等位基因是保护因素.
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一氧化氮对缺氧复氧处理的新生大鼠心肌细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B活性和表达的影响
目的 验证缺氧复氧诱发的新生大鼠心肌细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)的表达和活性的增加是否由一氧化氮(NO)介导.方法 分离的新生大鼠心肌细胞,随机分为正常组、缺氧复氧组、非特异性一氧化氮合成酶抑制剂L-NAME组(L-NAME组)、缺氧复氧和L-NAME组(L-NA+H/R组).心肌细胞中PTP-1B的活性和表达分别由405 nm的光谱测量仪和Western blot法检测.同时分析心肌细胞培养基中的NO的浓度和乳酸脱氢酶活性.结果 与正常组比较,缺氧复氧组中心肌细胞PTP-1B的活性和表达较高,(L-NA+H/R)组PTP-1B的活性和表达不高.与缺氧复氧组比较,(L-NA+H/R)组NO和乳酸脱氢酶浓度显著低.缺氧复氧组和L-NA+H/R组中的NO含量分别是正常组(100%)的(368±13)%和(61±7)%(P<0.005);缺氧复氧组、L-NAME+H/R组中的乳酸脱氢酶的活性值分别为41.2±6.7和23.6±4.8(P<0.05).结论 L-NAME预处理阻止了缺氧复氧诱发的大鼠心肌细胞中PTP-1B活性和表达的增加,提示缺氧复氧期间PTP-1B的变化是由NO介导的.
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中药补肾益气活血作用对生长受限胎鼠脑及肝细胞外信号调节激酶-1与丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1表达的影响
目的探讨补肾益气活血方剂对生长受限胎鼠脑及肝细胞外信号调节激酶-1(ERK-1)和丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)表达的影响.方法采用被动吸烟法建立孕鼠的生长受限模型,对48只孕鼠随机分成生长受限组(12只)、精氨酸治疗组(12只)、补肾益气活血方剂(简称中药)中药治疗组(12只), 另选12只正常孕鼠组成正常组.运用Western-blot方法,分别检测各组孕鼠所生产胎鼠的脑组织及肝组织内ERK-1和MKP-1的表达.结果 (1)脑组织:生长受限组、精氨酸治疗组、中药治疗组和正常组ERK-1的表达分别为7.63±0.22、10.03±0.41、11.03±0.30、11.44±0.09;MKP-1的表达分别为7.41±0.38、10.35±0.60、10.60±0.14、11.60±0.62.(2)肝组织: 生长受限组、精氨酸治疗组、中药治疗组和正常组ERK-1的表达分别为4.73±0.54、5.83±0.17、11.37±0.12、12.34±0.14;MKP-1的表达分别为9.07±0.61、10.66±0.08、14.27±0.73、14.92±0.17.(3)在肝组织和脑组织中,生长受限组ERK-1和MKP-1的表达较正常组明显降低(P<0.01),中药治疗组较生长受限组明显升高(P<0.01),且接近于正常组的表达水平(P>0.05).脑组织ERK-1的表达,中药治疗组较精氨酸治疗组明显升高(P<0.05);MKP-1的表达,两组比较,差异无显著性(P>0.05),肝组织ERK-1和MKP-1的表达中药治疗组较精氨酸治疗组都明显升高(P<0.01).结论补肾益气活血方剂通过影响ERK-1和MKP-1的表达,可引起生长相关基因表达增强和凋亡抑制,这可能是该方剂防治胎鼠生长受限的机制之一,且其作用优于精氨酸.
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酪氨酸磷酸酶PRL-3与肿瘤转移
肿瘤转移是恶性肿瘤具破坏性的特征,也是癌症患者的主要死因之一.经过研究者们多年的努力,对肿瘤转移的过程有了较为清晰的了解,开始以一些关键分子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等作为治疗的靶点,但是,目前对肿瘤转移及肿瘤复杂本质的认识还不足于取得治疗上的突破.
关键词： 酪氨酸磷酸酶PRL-3 肿瘤转移 蛋白质酪氨酸磷酸酶 -
抑郁症患者酪氨酸磷酸酶受体R亚型基因多态性与静息态脑功能磁共振成像的关联研究
目的：探讨抑郁症患者酪氨酸磷酸酶受体R亚型(protein tyrosine phosphatase receptor type R, PTPRR)基因rs1513105多态性对静息态脑功能的影响。方法对54例抑郁症患者（病例组）及43名性别、年龄、受教育年限匹配的健康志愿者（对照组）进行静息态磁共振成像扫描和PTPRR基因分型，探讨疾病状态、基因型的主效应和二者的交互作用。结果方差分析结果显示：（1）疾病状态为主效应：与对照组相比，病例组左颞上回(t=4.2082)、右缘上回(t=3.0271)、左顶上小叶(t=3.2122)局部一致性(regional homogeneity, ReHo)值升高(均P<0.05)；（2）基因多态性为主效应：与TT基因型组相比，G等位基因携带组左顶下小叶(t=3.1290)、左中央后回(t=3.2633)ReHo值升高(均P<0.05)，右尾状核(t=-3.4434)、右岛盖部额下回(t=-3.4445)、右侧小脑(t=-3.0793)ReHo值下降(均P<0.05)；（3）疾病状态与基因多态性的交互作用：与对照组相比，病例组G等位基因携带组较TT基因型组右颞下回(t=3.5602)、右三角部额下回(t=3.2961)ReHo值升高(P<0.05)，左颞上回(t=-4.3543)、左楔前叶(t=-4.0267)、左额上回(t=-3.6560)、左枕下回(t=-3.8054)、右缘上回(t=-3.4332)ReHo值下降(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示，病例组左枕下回ReHo值与认知障碍因子分(r=0.323, P=0.017)和睡眠障碍因子分(r=0.318, P=0.019)呈正相关，右缘上回ReHo值与认知障碍因子分(r=0.273, P=0.046)呈正相关。结论 PTPRR-rs1513105基因多态性与抑郁症的交互作用可能导致部分抑郁相关脑区静息态脑功能变化，并可能和抑郁症的发病机制有关。
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人圆锥角膜组织中白细胞抗原相关酪氨酸磷酸酶表达的研究
目的探讨白细胞抗原相关酪氨酸磷酸酶(LAR)在人圆锥角膜组织中的表达及其临床意义.方法收集2001年12月至2002年3月于北京同仁眼科中心行角膜移植手术的患者术中取下的角膜片,分离15例人圆锥角膜、7例正常角膜、6例大泡性角膜病变、3例无新生血管性角膜白斑和2例角膜营养不良标本的总RNA,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳分析.收集2002年7月至12月于北京同仁眼科中心行角膜移植手术的患者术中取下的角膜片,提取6例圆锥角膜、3例正常角膜、3例大泡性角膜病变、3例无新生血管性角膜白斑和2例角膜营养不良样本总蛋白,进行Western印迹法,用增强的化学发光法显迹.对LAR的RNA和蛋白的显迹条带分别采用相对定量RT-PCR和Western印迹法分析.结果使用等量总RNA进行RT-PCR后,圆锥角膜样本LAR扩增产物检测到强信号条带,正常和其他角膜疾病样本只检测到弱信号或检测不到信号.圆锥角膜的LAR扩增产物测序发现其mRNA有外显子13的删除.使用等量总蛋白进行Western印迹法分析,用LAR抗体检测发现:圆锥角膜样本有清晰的信号条带,正常和其他角膜疾病样本仅有弱信号或检测不到信号.结论 LAR的mRNA和蛋白表达量在圆锥角膜中明显增强,而在正常角膜、大泡性角膜病变、无新生血管性角膜白斑和角膜营养不良中表达很弱,甚至检测不到.LAR在圆锥角膜中的增强表达可能与圆锥角膜的发生有重要关系.圆锥角膜中LAR外显子13的删除可能与其自身功能有关.
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口腔鳞状细胞癌中蛋白酪氨酸磷酸酶基因的突变与表达
目的 探讨抑癌基因蛋白酪氨酸磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10,PTEN)的突变和基因表达水平变化在口腔鳞状细胞癌发生、发展过程中的作用.方法 应用聚合酶链反应(PCR)、基因测序方法检测42例口腔鳞状细胞癌和癌旁组织中PTEN第3、5、6、8外显子有无突变.应用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测上述病例癌组织及癌旁组织中PTEN mRNA的表达.结果 发现2例口腔鳞状细胞癌组织中PTEN第5外显子发生点突变.42例口腔鳞状细胞癌和癌旁正常组织中均有PTEN mRNA表达,口腔鳞状细胞癌组织中PTEN mRNA表达量[PTEN/磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)]为(0.36±0.12),低于相应癌旁正常组织(0.64±0.09),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 PTEN mRNA表达水平降低与口腔鳞状细胞癌的发生有一定关系.
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肝细胞肝癌组织及细胞株中PTPeta的表达及意义研究
目的 检测人肝细胞肝癌组织及细胞株SMMC7721中蛋白酪氨酸磷酸酶eta(PTPeta)的表达,观察肿瘤细胞生长密度对其表达的影响.方法 采用免疫组化方法检测肝细胞肝癌组织及SMMC7721细胞中PTPeta蛋白的表达；采用RT-PCR法检测不同生长密度(1×103、5×103、l×104、5×104/cm2)SMMC7721细胞中PTPeta的表达变化情况.结果 免疫组化检测结果表明肝细胞肝癌组织中PTPeta表达呈阳性,SMMC7721细胞中存在PTPeta表达,且定位于细胞膜；RT-PCR检测结果显示,当细胞密度为l×103、5×103、l×104、5×104/cm2时,PTPeta mRNA的表达量分别为0.425±0.031、0.659±0.041、0.771±0.043、0.885±0.045,PTPeta表达随着肿瘤细胞生长密度的增高而增加,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 PTPeta在肝细胞肝癌组织及细胞中表达,且随肿瘤细胞生长密度增高而表达增加.PTPeta 可能通过增加肝癌细胞黏附、维持恶性肿瘤细胞内环境稳定等,在恶性肿瘤细胞增殖及播散转移的过程中起重要作用.
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重楼甾体总皂苷对血小板聚集的直接诱导作用及初步机制研究
目的:确定重楼甾体总皂苷(TSSP)体外直接诱导血小板聚集作用并对其可能的机制进行探索.方法:比浊法测定血小板聚集,透射电镜观察血小板形态学改变.结果:体内外血小板聚集模型研究表明,TSSP体内给药能够增强ADP诱导血小板聚集.体外能够直接诱导血小板聚集,并呈剂量效应关系.电镜观察TSSP能够直接激活血小板引起变形释放等反应.肾上腺素能够增强TSSP诱导的血小板聚集,该增强作用能被酚妥拉明所拮抗.蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠能够增强TSSP诱导血小板聚集.结论:本研究表明,TSSP中含有参与止血作用的药理活性成分.
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染料木黄酮对豚鼠结肠平滑肌细胞L型钙通道的影响
目的 研究酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮(GST)对豚鼠结肠平滑肌细胞L型钙通道电流的作用.方法 木瓜蛋白酶法分离单个豚鼠结肠平滑肌细胞,应用全细胞式膜片钳技术记录L型钙通道电流.结果 GST (10～100 μmol·L-1)浓度依赖性地阻断L型钙通道电流,其作用可被洗脱,半数有效抑制浓度为(39.9±3.6)μmol·L-1.GST可使L型钙通道的稳态失活曲线向超极化方向左移约10 mV (P＜0.01), 对其斜率没有影响.GST的无活性拟似物大豆异黄酮对L型钙通道电流的作用明显小于GST.酪氨酸磷酸酶抑制剂原钒酸钠可阻断GST对钙通道电流的抑制作用.结论 GST可通过酪氨酸激酶途径抑制豚鼠结肠平滑肌L型钙通道.
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蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在肺癌中作用的研究进展
蛋白质可逆磷酸化修饰是细胞信号传导的主要事件。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2是由非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶11基因编码的蛋白酪氨酸磷酸酶，参与多条信号通路的活化。SHP2在肿瘤中特异性高表达，在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及耐药等方面都发挥了重要的作用，是肿瘤防治的一个潜在靶点分子。本文就SHP2与肺癌的发生、侵袭转移及耐药相关研究予以综述。
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PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体的构建及表达
目的:分别构建肝再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver 3,PRL-3)基因C104S位点突变和C端CAAX缺失的myc标签和GFP荧光标签重组质粒pcDNA3-myc-PRL-3(C104S)、pEGFP-PRL-3(C104S)、peDNA3-myc-PRL-3(△CAAX)和pEGFP-PRL-3(△CAAX),并进行真核表达,为PRL-3的后续功能研究提供有效的工具.方法:设计PRL-3基因C104S点突变、c端CAAX缺失的特异性引物,以peDNA3-myc-PRL-3质粒为模板,通过基因克隆、一步法点突变的方法构建各重组质粒,通过酶切和测序鉴定后转染真核细胞,检测其在细胞中的表达并观察定位情况.结果:成功构建了4种重组质粒,并能在结肠癌细胞LoVo中表达.用激光共聚焦扫描显微镜对细胞中绿色荧光融合蛋白的定位观察发现,当PRL-3的CAAX位点缺失后,PRL-3由内膜系统大量入核,与理论预期相符.结论:获得了PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体重组真核表达质粒并能在细胞中表达,为进一步研究PRL-3的功能提供了条件.
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SHP-2酪氨酸磷酸酶:信号转导机制及生物学作用
细胞对各种胞外诱因的应答反应是由胞内的信号传导通路调节的.大量事实表明,这种胞外因子所启动的信号传导通路的异常将导致靶细胞产生功能障碍并终死亡.
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含Shp-2的酪氨酸蛋白磷酸酶在神经肌肉接头形成中的作用
目的研究酪氨酸蛋白磷酸酶及含SH2结构域的酪氨酸蛋白磷酸酶(Shp-2)在神经肌肉接头形成过程中的信号调控作用.方法培养小鼠C2C12成肌细胞并使之分化为成熟的肌管细胞,应用免疫沉淀、免疫印记、RNA阻断(RNAi)以及显微荧光等技术检测酪氨酸磷酸酶、Shp-2在肌特异性受体酪氨酸激酶(MuSK)活化、乙酰胆碱受体(AChR)成簇过程中的作用.结果应用酪氨酸蛋白磷酸酶的抑制剂过钒酸盐(pervanadate)使MuSK活性增加,同时增加了非聚集蛋白(agrin)依赖的AChR聚集,与对照组(0.96簇/细胞)比较增加了6.7倍(6.43簇/细胞)(P<0.01);同时过钒酸盐也增加agrin依赖的AChR聚集;通过免疫印记筛选显示Shp-2是小鼠肌肉细胞的主要酪氨酸蛋白磷酸酶;阻断Shp-2蛋白表达后,MuSK活性以及AChR聚集增加.结论包括Shp-2在内的酪氨酸蛋白磷酸酶信号被抑制时,MuSK活性以及AChR聚集增加;被激活时则MuSK活性以及AChR聚集降低.
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蛋白酪氨酸磷酸酶1B在非小细胞肺癌组织中的表达及其与预后的关系
目的 探讨蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTP1B)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其对预后的预测价值.方法 运用免疫组织化学EnVision法,检测2000年6月至2006年10月南京军区南京总医院手术切除的经常规病理证实的63例NSCLC肺癌组织和9例肺炎组织中PTP1B的表达并进行统计学分析,探讨其与临床病理特征和预后的关系.结果 PTP1B在肺炎组织中均为阴性表达,在NSCLC组织中的表达阳性率为50.8％(32/63),显著高于肺炎组(x2=8.229,P=0.004)；PTP1B在NSCLC组织中的表达与性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移及化疗与否无明显相关,而与pTNM分期显著相关(X2=6.426,P=0.040).Kaplan-Meire生存分析显示,PTP1B表达与肺癌患者的总生存期明显相关(Log-rank,P=0.047).多因素Cox回归分析显示PTP1B的表达是影响NSCLC预后的独立因素(HR=2.050,P=0.044),pTNM分期也是影响NSCLC独立预后因素(HR =3.631,P=0.000).结论 PTP1B在肺癌发生发展中起重要的作用,PTP1B及pTNM分期是NSCLC独立的预后因素.
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淋巴瘤Daudi细胞SHP-1甲基化及5-杂氮脱氧胞苷抑制性效应的研究
目的 研究甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-2'deoxycytidine,5-Aza-CdR)对Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi细胞中的SHP-1抑癌基因的转录调控作用及对Daudi细胞生长增殖的生物学影响,寻找肿瘤治疗新靶点.方法 应用MTT法检测5-杂氮脱氧胞苷200.00,20.00,2.00,0.20μmol/L等不同剂量,作用24,48,72 h对Daudi细胞存活率的影响.应用流式细胞术观察5-杂氮脱氧胞苷作用1,3,5 d细胞周期及凋亡率的变化.用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态.RT-PCR、免疫组织化学法检测5-杂氮脱氧胞苷(2.00 μmol/L)处理前和处理7 d Daudi细胞SHP-1 mRNA及蛋白表达的变化.结果①经5-杂氮脱氧胞苷2.00μmol/L作用7 d的Daudi细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,未经5-杂氮脱氧胞苷作用的对照组Daudi细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变;②经5-杂氮脱氧胞苷作用7 d,SHP-1mRNA和蛋白均重新表达;③5-杂氮脱氧胞苷抑制Daudi细胞的增殖,在一定范围内与药物浓度及作用时间呈正相关,药物作用72 h,剂量为200.00,20.00,2.00和0.20μmol/L时,瘤细胞增殖的抑制率分别为72.0%,65.1%,51.5%,28.8%和23.4%;④5-杂氮脱氧胞苷可使Dandi细胞凋亡率增加,且作用也呈时间依赖性,用药1,3,5 d细胞凋亡率分别为2.3%,10.8%和17.1%;⑤5-杂氮脱氧胞苷对于细胞周期的影响,主要体现在S期和G1期,显著的是5-杂氮脱氧胞苷2.00μmol/L作用24 h后92.7%的细胞阻滞在S期;其次,在相同药物浓度下,G1期细胞数量随培养时间延长而增加,药物作用1,3,5 d时,G1期细胞分别占细胞总数的1.2%,7.9%和21.5%.结论 DNA异常甲基化是导致Daudi细胞SHP-1基因缄默的重要原因;特异性甲基转移酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷能较好地逆转Daudi细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致SHP-1基因缄默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长.5-杂氮脱氧胞苷有望成为新型抗肿瘤药物,对Burkitts淋巴瘤的疗效可能更佳.
