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小鼠体内RU486诱导的及肝脏特异性的IL-12基因表达
目的 研究含有RU486调控系统质粒的可诱导能力.方法 通过水流动力学注射的方法,将含有RU486调控系统、肝脏特异性启动子以及转基因IL-12的质粒pRS22注射到小鼠体内,质粒注射后不同时间点腹腔注射RU486.通过ELISA试剂盒检测血清中IL-12表达水平,通过PCR、RT-PCR以及免疫组织化学染色的方法,在DNA、RNA及蛋白质水平测试质粒pRS22在小鼠体内的可诱导性表达.结果 为了确定质粒pRS22活性的持续时间,在水流动力学注射10μg质粒后,每7天给小鼠注射1次RU486(250μg/kg),发现尽管每次诱导后血清中IL-12的水平逐渐下降,但直到质粒注射后第15周,仍然可以被诱导表达.为了测试不同诱导方式对IL-12表达趋势的影响,5μgpRS22被注射到小鼠体内后,在6d内分别每天或每两天给小鼠注射1次RU486.结果每两天诱导1次后IL-12表达呈波浪形,而每天诱导1次则可获得持续的IL-12表达.PCR和RT-PCR结果显示,无论有无RU486诱导,都能在肝脏检测到pRS22质粒及GLp65调节子mRNA的表达,但是仅能够在接受RU486的小鼠肝脏中观察到IL-12 p35亚基mRNA表达.免疫组织化学染色结果提示,IL-12蛋白只有在RU486作用下才会在肝细胞中表达.结论 在肝脏特异性启动子TTR控制下,RU486调控系统能够在时间和空间上精确控制转基因IL-12的表达.
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水流动力学注射介导的IL-12基因在小鼠体内的高效表达
目的:评估水流动力学注射法转移表达小鼠白细胞介素12(mIL-12)质粒pCMV-mIL-12的有效性,以及质粒DNA重复注射后转基因的表达情况.方法:通过小鼠尾静脉大体积快速注射pCMV-mIL-12质粒后取血及主要器官,应用ELISA、PCR、RT-PCR及免疫组织化学染色等方法,检测质粒在组织器官中的分布与表达.为了研究重复注射质粒后mIL-12的表达,分别在首次注射后第7天、第14天和第30天二次注射相同剂量的质粒.每次注射前及注射后均取血检测mIL-12的表达及其诱导产生的IFN-γ及NO.结果:注射后10小时血清中的mIL-12蛋白水平高,第7天恢复到基线值,其表达呈DNA剂量依赖性.IFN-γ及NO的表达高峰均出现在注射后第3天.首次注射后第14天及第30天重复注射可获得mIL-12的再次高效表达.结论:水流动力学注射方法是一种简便、有效的体内IL-12基因转移方式.重复应用水流动力学注射方法体内转移表达mIL-12的裸DNA后,可以获得转基因的再次高效表达,两次注射间隔时间至少为14天.
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水流动力学注射方法对小鼠肝脏的毒性
目的评价水流动力学注射方法对小鼠肝脏的毒性.方法通过小鼠尾静脉快速注射1.7 ml生理盐水溶液,于注射后不同时间点取血检测ALT及AST水平并取肝脏进行形态学观察.结果注射10 h后,ALT及AST水平高,24 h后迅速下降,7天后恢复到正常水平.8 s注射组注射后10 h光镜下未见明显病理改变,电镜下可见线粒体轻微肿胀,3天后肝细胞超微结构恢复正常.3 s注射组注射后10 h表现为肝窦明显扩张充血,电镜下可见大部分线粒体内出现絮状沉积物,24 h出现小片坏死区域,7天后基本恢复到正常结构.结论水流动力学注射对肝脏的损伤程度与注射速度有关,损伤可在1周内迅速恢复.
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水流动力学注射介导的IL-12基因对小鼠恶性腹水的治疗作用
目的:应用水流动力学注射基因转移法转移白细胞介素12(IL-12)基因,观察其对小鼠恶性腹水的治疗效果.方法:通过小鼠腹腔注射H22肿瘤细胞建立恶性腹水模型.将小鼠分为3组,接种后第3天通过水流动力学注射方法分别注射质粒pCMV-mIL-12、pCMVβ和生理盐水(NaCl)进行治疗.治疗后一定时间点取血检测血清中IL-12、干扰素-γ(IFN-γ)和一氧化氮(NO)的含量.注射后第14天各组分别处死3只小鼠,测量腹水体积,腹水细胞进行HE和AO/EB染色.其余小鼠用于观察生存期.结果:与只注射pCMVβ或生理盐水的小鼠相比,接受pCMV-mIL-12治疗的小鼠的生存时间明显延长(P<0.01),而且小鼠血清中IL-12、IFN-γ和NO水平明显升高(P<0.01或P<0.05),小鼠腹水中有活力的肿瘤细胞明显减少(P<0.01),凋亡的细胞增多(P<0.01).结论:水流动力学注射介导的IL-12基因表达减少了恶性腹水小鼠的血性腹水生成并诱导肿瘤细胞凋亡,从而延长了小鼠生存期.
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水流动力学注射对小鼠肝损伤及肝脏的自然修复作用
目的:观察水流动力学注射所致肝组织损伤的形态学特点,探讨肝脏修复的过程和机制.方法:25只雌性Balb/c小鼠在3 s内经尾静脉注射大体积(1.8~2.0 mL)生理盐水.根据注射后时间将小鼠分为30 min组、8 h组、1 d组、3 d组和7 d组,每组5只鼠.6只未注射雌性Balb/c小鼠作为对照组.小鼠内眦静脉取血,检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平.利用苏木精-伊红(HE)染色观察各组小鼠肝脏形态学,免疫组织化学染色检测各组小鼠肝细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达情况.利用 Real-time PCR法检测各组小鼠肝组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)、Cyclin D1、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Bax和Bcl-2的 mRNA表达水平.结果:与对照组比较,8 h组小鼠肝质量/初始体质量比值明显下降(P<0.05),7 d组差异无统计学意义(P>0.05).与对照组比较,1 d组小鼠血清中 ALT 水平明显升高(P<0.01),7 d 组差异无统计学意义(P>0.05).显微镜下,与对照组比较,30 min组小鼠出现肝细胞肿胀及少量出血,每高倍视野下肝细胞数量明显减少(q=4.760,P<0.05).与30 min组比较,8 h组小鼠肿胀的肝细胞数量减少,出血坏死灶扩大,每高倍视野下的肝细胞数和双核细胞数均明显增多(q=7.310,P<0.01;q=7.200,P<0.01).与8 h组比较,1 d组小鼠出血坏死灶减少,肝细胞数和双核细胞数均减少(q=4.966,P<0.05;q=6.596,P<0.01),但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).3 d组小鼠坏死灶基本消失,7 d组小鼠肝脏结构与对照组相似.与对照组比较,8 h组和1 d组小鼠肝细胞 PCNA指数均明显升高(t=4.458,P<0.01;t=15.557,P<0.01),7 d组差异无统计学意义(P>0.05).与对照组比较,30 min 组小鼠胆管细胞 PCNA 指数明显升高(t=3.985, P<0.01),7 d组差异无统计学意义(P>0.05).30 min组TNF-α、IL-6、EGF和 VEGF mRNA表达水平明显高于8 h组(q=4.952,P<0.05;q=14.750,P<0.01;q=14.750,P<0.01;q=13.551,P<0.01).3 d组小鼠肝组织中 HGF mRNA 表达水平明显高于30 min 组和8 h组(q=5.031,P<0.05;q=4.631,P<0.05), 8 h组和3 d组小鼠肝组织中 TGF-α mRNA表达水平均明显高于30 min 组(q=4.592,P<0.05;q=8.137, P<0.01).8 h组和 1 d组小鼠肝组织中 Cyclin D1 mRNA表达水平均明显高于 7 d 组(q=4.736,P<0.05;q=5.213,P<0.05).1 d组小鼠肝组织中 Bax和 Bcl-2 mRNA表达水平比值明显高于 30 min组(q=5.731, P<0.01).结论:水流动力学注射可引起急性肝损伤,表现为肝细胞肿胀并形成出血坏死灶.肝损伤在 1 周左右可自然修复,与肝再生有关的多种细胞因子和生长因子参与修复过程.
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辐照对水流动力学注射介导的小鼠体内基因表达的影响
目的 探寻辐照对水流动力学注射(HGT)介导的荧光素酶报告基因在小鼠体内的表达影响,从而评估水流动力学注射方法在小鼠造血干细胞移植模型中应用的有效性.方法 将实验鼠分为辐照组和非辐照组,尾静脉大体积快速注射带有荧光素酶报告基因的真核表达质粒PGL3-luc.于注射后6 h腹腔注射荧光素酶底物,并通过活体动物体内光学成像系统检测基因表达的初始水平.将辐照组小鼠进行700c Gy非清髓性全身照射,并于水流动力学注射后12、24、48、72、96、120 h通过活体动物体内光学成像系统对两实验组小鼠体内目的基因的表达水平进行监测.结果 通过尾静脉进行水流动力学注射的PGL3-luc质粒在注射后6 h于小鼠肝脏大量表达,其平均表达水平为(3 739±924.8)相对荧光单位(RLU)/(sec·mg)蛋白.在各个时间监测点辐照组与非辐照组相比实验鼠体内基因表达水平差异均有统计学意义(均P>0.05),其表达水平均于水流动力学注射72 h后显著降低.结论 小鼠移植前的辐照预处理对水流动力学注射介导的基因在小鼠体内的表达并无影响,该种新型基因转移表达方法可以有效地应用于小鼠造血干细胞移植模型中.
关键词： 水流动力学注射 辐照 造血干细胞移植 活体动物体内光学成像系统 -
水流动力学注射方法建立肝内胆管癌动物模型
目的 建立一种小鼠肝内胆管癌动物模型.方法 采用水流动力学注射方法将表达Notch1基因胞内区活性形式pT3-EF1a-Notch1分子的胞内结构域(NICD1)转座子和表达myr-蛋白激酶B(Akt)基因转座子质粒溶液通过小鼠尾静脉注射至肝脏.注射生理盐水作为对照.注射4周后处死,病理学检查肿瘤发生情况,免疫组织化学、免疫荧光检测细胞角蛋白19(CK19)及标签蛋白流感病毒血凝素蛋白表面抗原决定簇衍生的蛋白标签序列(HA)标记的Akt表达.结果 实验组小鼠均形成肿瘤,成癌率为100%(14/14);病理学检测为胆管细胞性肝癌,免疫组织化学检测CK19,14例中有9例强阳性表达(64.3%),证实瘤细胞是胆管细胞性肝癌.同样,在瘤细胞中检测到HA强阳性表达率为42.9%(6/14);免疫荧光双标记CK19和HA升高.结论 水流动力学注射方法成功构建肝内胆管癌小鼠模型且诱癌时间短,方法简单,重复性好.
