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人外周血T细胞系间接识别SLAⅠ类分子引起的异种细胞增殖反应
目的确认猪→人异种移植中存在针对猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA)Ⅰ类分子的间接识别而引起的急性细胞性排斥. 方法用纯化的中国版纳猪SLAⅠ类P1基因工程蛋白为抗原,体外反复刺激健康人外周血T细胞,建立P1特异性T细胞系.观察抗原特异性CD4+ T细胞系在自身APC存在下对版纳猪外周血单个核细胞与软骨细胞的反应性,以及HLA-DR单抗与氯喹的阻断作用. 结果建立10株SLAⅠ类P1抗原特异性T细胞系,其中8株以TCRαβ+CD4+为主要表型,将其合并使用.该CD4+ P1特异性T细胞系在自身APC存在下对相同品系版纳猪PBMC与软骨细胞均产生显著增殖反应.经抗人HLA-DR单抗与氯喹处理均能明显阻断其增殖反应. 结论健康人外周血T细胞可通过间接识别SLAⅠ类抗原对版纳猪细胞产生明显应答.
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用于异种移植的新型基因改造猪的培育
目的：培育用于异种移植的新型基因改造猪，在α-Gal基因敲除以及膜辅蛋白CD46、血栓调节蛋白（ TM）基因转入的基础上，进一步将Ⅱ类反式激活因子基因N端缺失显性负向（CⅡTA-DN）基因转入猪胎儿成纤维细胞，以抑制猪白细胞抗原（SLA）Ⅱ类分子的表达。方法设计合成博来霉素（ Zeocin）抗性基因片段，并将其与含有CⅡTA-DN基因的pST205载体连接，构建置于人Tie2增强子和CMVβ-actin启动子下游的pNMU105／CⅡTA-DN表达载体，将线性化的pNMU105通过脂质体转染法转入已经敲除了α-Gal并转入CD46、TM基因的猪胎儿成纤维细胞181B（DKO／CD46／TM）。 Zeocin抗性筛选转染pNMU105质粒的181B细胞，PCR方法检测CⅡTA-DN基因在181 B细胞中的转入，获得阳性单克隆并进行核移植，得到DKO／CD46／TM／CⅡTA-DN转基因猪。取仔猪的耳缘组织裂解后进行基因鉴定。结果成功设计Zeocin抗性基因片段并构建pNMU105／CⅡTA-DN表达载体，经过质粒转染和Zeocin抗性药物筛选获得多株阳性单克隆，顺利通过核移植得到转基因猪。仔猪耳缘组织经PCR鉴定，在592 bp位置检测到预期条带，证明均为CⅡTA-DN转基因阳性。结论通过新型基因改造猪的培育，在抑制超急性排斥反应和补体反应、降低凝血和人CD4＋T细胞免疫反应的理论基础上进行了转基因模型猪的构建，为异种移植中更加有效地减少免疫损伤、提高移植器官的存活做出了新的尝试。
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中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化
目的:获得原核表达的中国版纳猪SIAI类P1蛋白质分子.方法:PCR扩增去信号肽的SIAl类P1 cDNA序列,亚克隆至pCEMT载体,测序.将亚克隆的P1 cDNA片段插入表达载体pET42b(+),构建重组表达质粒pET-42b(+)/sla-p1,转化E-coli表达菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,IFIG诱导P1-8×his融合蛋白表达,经包涵体洗涤,8mol/L尿素变性溶解,Ni2+亲和层析,梯度透析后,定量保存.SDS-PAGE、western-blotting鉴定目的蛋白的表达与纯化.结果:目的蛋白(分子量39.5 kD)表达量占细菌总蛋白15%,每升表达菌获得纯度95%的目的蛋白40mg～60mg.结论:成功建立猪SLA分子全长原核表达、纯化体系,为建立间接识别猪移植抗原SLAI类分子的人T细胞系及表位分析打下基础.
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建立猪MHCⅠ类抗原特异性人T细胞系的探讨
目的建立间接识别中国版纳猪SLA Ⅰ类P1分子的特异性人T细胞系的方法,以进一步研究SLA Ⅰ类分子的间接识别在猪→人异种细胞性排斥中的作用.方法以E*coli中表达并纯化的SLA Ⅰ类分子P1为抗原,体外反复刺激健康人PBMC,3H-TdR掺入法筛选特异性增殖的T细胞,FACS作表型初步分析.结果初步测定健康人外周血版纳猪SLA Ⅰ类P1分子特异性T细胞反应频率约6.67×10-7,所建4个T细胞系表型均为TCRαβ+,其中3 株以CD4+为主,1株以CD8+为主.结论利用E.coli表达的纯蛋白抗原可建立间接识别版纳猪SLA Ⅰ类P1分子的特异性人T细胞系.
