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5-杂氮胞苷诱导人淋巴细胞系Molt-4细胞PD-1基因启动子去甲基化及PD-1蛋白表达的影响
目的 以T淋巴细胞株Molt-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-Zac)对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(PD-1)基因肩动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间的关系.方法 以不同浓度的5-Zac(0、5、10μmoL/L)作用于体外培养的Molt-4细胞72 h,流式细胞术(FCM)检测细胞表面表达PD-1的Molt-4细胞比例和细胞凋亡率;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测5-Zac作用后PD-1基因mRNA的转录水平;亚硫酸氧钠处理各组Molt-4细胞DNA,PCR扩增与转录因子Brn-2结合的PD-1启动子基因片段,转化感受态大肠杆菌,挑克隆测序,检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态.结果 0、5、10μmol/L的5-Zac作用于Molt-4细胞72 h后,PD-1在细胞表面的表达率分别为1.13%4±0.01%、18.96%±1.87%、63.09%±6.25%,并呈现浓度依赖性(P<0.05);PD-1基因mRNA表达量显著增加;细胞凋亡检测结果显示与未处理组相比,5-Zac处理72 h后Molt-4细胞的凋亡率显著增加,3组凋亡率分别为1.9%4±0.06%、8.98%4±1.36%、24.5%4±3.68%,差异有统计学意义(P<0.01);3组DNA亚硫酸氢钠测序结果表明,5-Zac处理后,与转录因子Bin-2结合位置的CG点明显受到去基化影响,其去甲基化概率与周围其他CG点去甲基化概率比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 甲基化抑制剂5-Zac可导致体外培养的淋巴细胞系Molt-4细胞表面PD-1表达显著增加,PD-1基因mRNA表达增加,细胞凋亡率增高;PD-1基因活化和表达的增加可能与5-Zac降低PD-1基因启动子上与转录因子Bin-2结合位置的CG点甲基化水平,从而促进Brn-2与基因启动子结合,使转录表达增加有关.
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硼替佐米联合5-杂氮胞苷抑制JAK/STAT信号通路对T细胞淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究硼替佐米联合5-杂氮胞苷对T细胞淋巴瘤细胞增殖、凋亡及机制.方法 对照组Jurkat细胞以3μmol· L-15-杂氮胞苷处理,低、中、高剂量实验组以10,30,50 nmol·L-1的硼替佐米+3 μmol·L-15-杂氮胞苷处理,空白组加等量生理盐水.用噻唑蓝(MTr)法及流式细胞术检测细胞增殖、凋亡,用蛋白免疫印迹法检测细胞JAK/STAT信号通路蛋白表达.结果 干预72h后,对照组和低、中、高剂量实验组细胞增殖抑制率分别为(39.05±2.63)％,(31.26±2.43)％,(60.12±3.05)％,(72.16±3.64)％.干预24,48,72 h后,中、高剂量实验组细胞增殖抑制率均高于对照组,且随硼替佐米浓度增大及作用时间延长逐渐升高(P＜0.05).干预48 h后,对照组和低、中、高剂量实验组细胞凋亡率均显著高于空白组.对照组和低、中、高剂量实验组细胞增殖指数低于空白组,凋亡率高于空白组(均P＜0.05);且实验组增殖指数均低于对照组,细胞凋亡率均高于对照组(均P＜0.05).空白组、对照组和低、中、高剂量实验组Janus激酶1(JAK1)蛋白相对表达量为2.68±0.22,2.15±0.31,1.82±0.25,1.53±0.15,0.89±0.14,TYK2蛋白相对表达量为3.84±0.56,2.25 ±0.46,2.37±0.39,2.26±0.33,1.28±0.26;对照组和低、中、高剂量实验组Janus激酶1(JAK1)、TYK2蛋白相对表达量均低于空白组(均P＜0.05),低、中、高剂量实验组JAK1蛋白及高剂量实验组TYK2蛋白相对表达量低于对照组(均P＜0.05).结论 硼替佐米可协同增强5-杂氮胞苷抑制T细胞淋巴瘤细胞的增殖,并促其凋亡,其作用机制与显著抑制JAK/STAT信号通路中蛋白表达有关.
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DNA去甲基化对肝细胞人端粒酶逆转录酶上调的研究
目的:观察肝细胞系L02及肝癌细胞系SMMC-7721中人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的表达与DNA甲基化修饰之间的相关性,观察5-杂氮胞苷(5'-aza-dC)去甲基化对肝细胞系hTERT表达和端粒酶活性的影响.方法:应用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)分析肝细胞系L02和肝癌细胞SMMC-7721中hTERT的甲基化状态,采用RT-PCR和TRAP-ELISA法检测5'-aza-dC干预对培养细胞hTERT mRNA表达及端粒酶活性的影响.结果:肝细胞系L02中hTERT有甲基化修饰,5'-aza-dC去甲基化处理上调hTERT mRNA表达并呈现端粒酶活性升高;肝癌细胞系SMMC-7721中hTERT则没有甲基化修饰,5'-aza-dC去甲基化处理对其hTERT表达和端粒酶活性无影响.结论:肝细胞中DNA甲基化可能参与抑制肝细胞hTERT的表达,hTERT去甲基化可能是肝癌发生发展的重要机制之一.
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DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原的调节
背景:DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰.目的:观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响.方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组化法鉴定骨髓间充质干细胞CD44和CD45蛋白的表达,MTT法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响,免疫组化法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原蛋白表达的影响.结果与结论:①第3代骨髓间充质干细胞不表达或低表达CD45,高表达CD44.②与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48 h,6,12,24 μmol/L组显著促进细胞增殖活性(P<0.05),无浓度依赖性.③与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48 h,6,12,24 μmol/L 组增殖细胞核抗原蛋白积分吸光度值显著增加 (P<0.05),组间差异无显著性意义.结果显示在一定浓度范围内,5-杂氮胞苷发挥去甲基化作用,激活增殖细胞核抗原蛋白表达,从而促进骨髓间充质干细胞增殖.
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在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化
背景：人脐带间充质干细胞属于一类特殊的干细胞，该类细胞数量有限，且分离、纯化难度系数较大，并且临床上对于该类细胞生物学特性缺乏认识。
目的：研究人脐带间充质干细胞的生物活性特性，探讨人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用。方法：无菌采集剖宫产新生儿脐带，在胶原酶Ⅱ下进行消化，采用组织块培养法分离人间充质干细胞。利用免疫细胞化学染色检测细胞表面标志，观察细胞形态学特性，并采用MTT法检测细胞增殖绘制其生长曲线，将获得的人脐带间充质干细胞进行培养，待细胞生长到70%-80%融合时，采用10μmol/L 5-杂氮胞苷进行24 h诱导。
结果与结论：①组织块贴壁法培养1周后：可见人脐带间充质干细胞，去组织块加入培养液培养后，人脐带间充质干细胞集落生长；②第3代及第10代人脐带间充质干细胞接种24 h内：细胞为潜伏期，此后呈对数生长，倍增时间为30 h；③免疫细胞化学染色结果显示：第3代细胞90%以上表达基质细胞相关表面标志物CD44、CD29等，不表达造血及内皮细胞标志物CD28、CD31；④人脐带间充质干细胞诱导3周后：细胞突起消失，出现不规则形状，诱导4周后呈现圆形，且表达心肌特异性免疫标志物。⑤结果提示人脐带间充质干细胞具备较强的增殖能力：分离的细胞具备充质干细胞的基本生物学特性，能够在5-杂氮胞苷诱导下分化为心肌样细胞。 -
U937细胞系RFC1基因甲基化状态对细胞周期和凋亡的影响
目的 探讨急性单核细胞样细胞系U937的还原叶酸载体基因(RFC1)启动子甲基化表达及其转录状态,并观察甲基化水平的改变对甲氨蝶呤(MTX)诱导的细胞凋亡和周期的影响.方法 运用定量甲基化特异性PCR和实时荧光定量PCR检测U937细胞系经5-杂氮胞苷作用后的启动子甲基化状态及其RFC1基因转录表达水平.通过流式细胞术验证RFC1基因表达变化对MTX诱导的U937细胞凋亡和细胞周期的影响.结果 U937细胞RFC1启动子的非甲基化率为(8.09±0.87)％,处于高甲基化状态;经1、2、4 μmol/L的5-杂氮胞苷作用72 h后,非甲基化率分别为(9.44±2.01)％、(13.51±2.19)％、(15.76±1.65)％;2、4μmol/L的5-杂氮胞苷作用后,RFC1的非甲基化率较对照组明显升高(P =0.005,P=0.001).2、4μmol/L的5-杂氮胞苷处理后,RFC1 mRNA表达量上升,差异有统计学意义(P=0.003,P=0.000).2μmol/L 5-杂氮胞苷可抑制细胞S期,同时G1期细胞增加;5 nmol/L的MTX引起细胞凋亡,并特异性作用于S期;两者联用可显著增加细胞凋亡,增强S期的抑制作用.结论 U937细胞系中RFC1基因启动子存在异常高甲基化,5-杂氮胞苷可引起去甲基化作用,并引起RFC1表达增加,从而增加MTX引起的细胞凋亡,特异性抑制细胞周期S期.
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甲基化抑制剂5-杂氮胞苷对T淋巴细胞株程序性死亡受体-1基因启动子区域甲基化水平及其表达的影响
目的:以T淋巴细胞株Molt-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azacytidine,5-Zac)对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(programmed death receptor 1,PD-1)基因启动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间的关系.方法:以不同浓度的5-Zac分组(0 μmol/L组、5μmol/L组、10 μmol/L组)作用于体外培养的Molt-4细胞72 h,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞表面表达PD-1的Molt-4细胞比例和细胞凋亡率；反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测5-Zac作用后PD-1基因mRNA的转录水平；亚硫酸氢钠处理各组Molt-4细胞DNA,PCR扩增PD-1启动子基因片段,转化感受态大肠杆菌,挑克隆测序,检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态.结果:0μmol/L组、5μmol/L组、10 μmol/L组的5-Zac作用于Molt-4细胞72 h后,PD-1在细胞表面的表达率分别为(1.13±0.01)％,(18.96±1.87)％和(63.09±6.25)％,并呈现浓度依赖性；PD-1基因mRNA表达量显著增加；细胞凋亡检测结果显示:与0μmol/L组相比,5μmol/L组、10 μmol/L组5 -Zac处理72 h后Molt-4细胞的凋亡率显著增加,0μmol/L组、5μmol/L组、10μmol/L组凋亡率分别为(1.9±0.06)％,(8.98±1.36)％和(24.5±3.68)％,差异有统计学意义(P＜0.01)；上述3组DNA亚硫酸氢钠测序结果表明:加入甲基化抑制剂5 -Zac处理后,PD-1启动子上-601 bp和-553 bp CpG点去甲基化程度明显增高.结论:甲基化抑制剂5 -Zac可导致体外培养的T淋巴细胞系Molt-4细胞表面PD-1 mRNA表达显著增加,细胞凋亡率增高,这种增高可能与PD-1基因启动子区域出现的去甲基化有关.
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5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响
目的:研究DNA低甲基化对穿孔素基因mRNA和蛋白表达的影响.方法:密度梯度离心分离正常成人的外周血淋巴细胞,磁珠分离CD4和CD8细胞后进行细胞培养,DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azaC)处理.分别提取DNA、RNA和蛋白质.亚硫酸氢钠处理DNA,巢式PCR进行扩增、转化入大肠杆菌,挑取克隆测序.实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测穿孔素mRNA的表达,Western印迹检测穿孔素蛋白量的变化.结果:5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞穿孔素mRNA和蛋白表达显著高于未处理的CD4和CD8细胞组(P＜0.05).测序结果显示5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞DNA穿孔素启动子区域的甲基化水平降低,与未处理的CD4和CD8细胞组比较差异有统计学意义(P＜0-05).结论:5-azaC处理后CD4和CD8细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的表达都有显著的增高,这种增高与CD4和CD8细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关.
