首页 > 文献资料
-
幽门螺杆菌UreB抗原表位预测及其有效表位噬菌体展示的筛选
目的 筛选幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)分子中的抗原表位,为研制多抗原肽(MAP)疫苗奠定基础.方法 采用生物信息学技术对UreB的T细胞和B细胞表位进行预测和分析.构建ureB基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rUreB,常规皮内免疫法制备兔抗血清.选择UreB主要T细胞和B细胞联合表位肽并构建其噬菌体展示系统,PEG/NaCl沉淀法提纯重组噬菌体,SDS-PAGE鉴定目的重组PⅢ蛋白(rPⅢ).分别以商品化抗Hp全菌IgG和rUreB抗血清为一抗,采用Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选.结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的ureB基因核苷酸和氨基酸相似性分别为96%～99.5%和96%～100%.rUreB表达量约为细菌总蛋白的52%,提纯后仅见单一蛋白条带.预测的4个主要表位肽UreB230、UreB322、UreB479和UreB527在M13噬菌体中获得成功表达,采用不同一抗的Western blot均显示相似的阳性结果,但UreB322和UreB527反应强度明显高于UreB230和UreB479.结论 本研究成功地构建ureB基因高效原核表达系统和UreB主要T细胞和B细胞联合表位肽噬菌体展示系统.所采用的生物信息学技术可有效地预测抗原表位.UreB322和UreB527是UreB有效抗原表位,可作为幽门螺杆菌MAP疫苗的候选表位.
-
基于幽门螺杆菌UreB优势抗原表位多抗原肽疫苗制备及其免疫保护作用
目的 构建串联式幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527原核重组表达系统,制备UreB322和UreB527表位与多肽载体Poly-Asp-Lys的多抗原肽(MAP)疫苗并确定其免疫原性和免疫保护性.方法 采用连接引物PCR构建含肠激酶(EK)位点的串联式UreB322和UreB527表位基因及其原核表达系统.表达的目的重组融合蛋白8×[rEK-UreB322-EK-UreB527-EK]经EK水解后用Sephadex G-25柱分离rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.采用碳二亚胺法将rUreB322-EK、rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys载体分子交联,制备出多抗原肽疫苗MAP-rUreB322/B527.采用ELISA和Western blot分别检测各重组表位肽及MAP-rUreB322/527的抗原性和免疫反应性.采用幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠模型检测MAP-rUreB322/527免疫保护效果.结果 获得了8次重复串联的UreB322和UreB527编码基因及其原核表达系统,目的融合蛋白8×[rEKUreB322-EK-rUreB527-EK]表达量可达细菌总蛋白的48％.肠激酶可将目的融合蛋白完全水解为rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.rUreB322-EK和rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys交联率高达92.5％.幽门螺杆菌全菌抗体及rUreB-IgG均能识别rUreB322-EK、rUreB527-EK和MAP-rUmB322/527并与之结合.MAP-rUreB322/527免疫小鼠血清抗体水平明显高于rUreB(P＜0.05).50或100μgMAP-rUreB322/527对幽门螺杆菌SS1株感染小鼠的保护率(83.3％和91.7％)明显高于等量rUreB(41.7％和50.0％)(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527重复串联式编码基因及其原核表达系统,基于UreB优势抗原表位的多抗原肽疫苗MAPrUreB322/527能显著提高免疫保护效果.
-
H.pylori尿素酶B亚单位在保加利亚乳杆菌的表达与鉴定
目的 构建表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H pylori)尿素酶B亚单位(UreB)的基因工程乳杆菌,并对其进行初步的安全性评估.方法 采用高保真PCR从H.pylori标准菌株NCTC 11637中扩增ureB基因,插入乳酸菌表达质粒pMG36e,将重组质粒电转入保加利亚乳杆菌L6032中,获得表达ureB的基因工程乳杆菌.在含乳糖的MRS培养基诱导目的 蛋白表达,Western blot鉴定其免疫原性.连续传代培养60代,检测基因工程乳杆菌的稳定性、形态学与生理生化特性以进行初步的安全性评估.结果 特异PCR、酶切和测序鉴定均证实ureB基因克隆入表达载体pMG36e,SDS-PAGE结果显示,重组质粒pMG36e-ureB电转入保加利亚乳杆菌所构建的基因工程乳杆菌能表达约64KD的蛋白,Western blot证明该蛋白能与抗H.pylori ureB的兔血清反应.稳定性、形态学与生理生化特性检测结果表明,基因工程乳杆菌与原始菌株保加利亚乳杆菌完全一致.结论 成功构建能表达H.pylo-ri UreB的保加利亚乳杆菌L6032-UreB,该基因工程菌在形态与生理生化特性上未发生任何变异,从而为探索幽门螺杆菌感染的益生菌制剂调理疗法奠定了坚实的基础.
