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阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除株的构建及其生物学特性
目的 构建阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除株,并探讨blaNDM-1基因缺失对阴沟肠杆菌生物学特性的影响.方法 采用Red同源重组技术构建阴沟肠杆菌blaNDM-1敲除株并通过PCR和RT-qPCR法进行验证,对原始菌株和blaNDM-1敲除株进行药敏试验、生长曲线绘制和体外竞争试验.结果PCR、DNA测序和RT-qPCR表明成功构建阴沟肠杆菌blaNDM-1敲除株.药敏试验显示原始菌株对亚胺培南、美罗培南和厄他培南均耐药,而blaNDM-1敲除株对其均敏感;原始菌株和基因敲除株在LB液体培养基中具有相似的增殖曲线;两者体外竞争试验的竞争指数值为0.69.结论 Red同源重组技术可用于阴沟肠杆菌基因的敲除,且blaNDM-1基因对阴沟肠杆菌的耐药性及竞争力都有影响.
关键词： 阴沟肠杆菌 blaNDM-1基因 Red同源重组 基因敲除 -
河北省3株携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌基因及耐药性检测
目的 了解河北省3株携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌的基因序列及其耐药性.方法 通过生化鉴定、基因测序和药敏试验对河北省保定市和承德市肝癌晚期、输尿管结石和慢性肾衰竭3例住院患者分离的3株菌株进行基因序列及其耐药性检测.结果 生化鉴定结果表明,3株菌株为携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌;blaNDM-1基因测序结果与国外基因序列比对,同源性为100％;药敏试验结果显示,3株菌株均对氨基糖苷类抗生素敏感,其中12280010P1、12280010P2两菌株对氟喹诺酮类抗生素敏感.结论 河北省存在携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌,耐药问题形势严峻,需要加强监测力度.
关键词： 阴沟肠杆菌 blaNDM-1基因 耐药性 -
一株解鸟氨酸克雷伯菌的鉴定和碳青霉烯类耐药基因的检测
目的 对来自住院患者血液标本分离出的1株菌株进行鉴定及碳青霉烯类抗生素耐药的基因型分析.方法 利用DL-96Ⅱ细菌测定系统进行菌株B1635-1的初步鉴定及药敏试验;采用PCR法扩增菌株B1635-1的16S rDNA基因序列;应用MEGA 5.0软件构建菌株B1635-1的系统发育树,确定其种属地位;采用PCR法克隆菌株B1635-1的碳青霉烯类耐药基因.结果 DL-96Ⅱ细菌测定系统初步鉴定菌株B1645-1为解鸟氨酸克雷伯菌,并显示该菌株对除氨曲南以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药,对磺胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素也耐药,但对四环素类抗生素敏感.对菌株B1645-1的16S rDNA基因序列的系统发育树分析,终鉴定该菌为解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica).菌株B1645-1扩增出编码碳青霉烯酶blaNDM-1基因,未扩增出编码碳青霉烯酶blaKPC、blaVIM、blaTME和blaSHV基因.结论 首次从湖北医药学院附属东风医院住院患者的血液标本中成功分离获得一株携带blaNDM-1基因解鸟氨酸克雷伯菌株,产NDM-1型碳青霉烯酶是该株解鸟氨酸克雷伯菌耐碳青霉烯类药物的主要原因,为临床鸟氨酸克雷伯菌的感染治疗提供参考依据.鉴于肠杆菌科细菌耐药速率传播更快,警示相关部门应重视并加强对blaNDM-1基因携带菌的监测与筛查.
关键词： 碳青霉烯类 耐药性 解鸟氨酸克雷伯菌 blaNDM-1基因 -
携带blaNDM-1基因革兰阴性杆菌的分子流行病学研究
目的 了解临床分离碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌中blaNDM-1基因的分布,探讨NDM-1阳性菌株的分子流行病学特征.方法 收集长沙地区2011年1月-2012年8月临床分离非重复碳青霉烯类不敏感革兰阴性杆菌,聚合酶链反应(PCR)技术筛查blaNDM-1基因,扩增产物测序和BLAST软件分析.对blaNDM.1基因阳性菌株,采用E试验法检测其药物敏感性、PCR法检测β内酰胺酶基因(包括blaDHA、blavIM、blaIMP、blaGIM、blaCTX-M、blaPC、blaTEM和blaSHrV等)和16SrRNA甲基化酶基因、脉冲场凝胶电泳(PFGE)及多位点序列分型(MLST)技术进行分子生物学分型.结果 共收集到687株碳青霉烯类不敏感的革兰阴性杆菌,其中3株被证实为blaNDM-1基因阳性菌株,包括2株肺炎克雷伯菌(菌株编号CS11495和CS610)和1株阴沟肠杆菌(菌株编号CS30754).该3株菌均来源于湘雅医院.在测试的12种抗菌药物中,除对阿米卡星和多黏菌素B敏感外,对其余抗菌药物几乎全耐药.菌株CSl1495同时检出blaSHv-12、blaTEM-1、blaCTX-M-15和bla1MP-4,菌株CS610携带blaDHA、blaSHV-12和blaTEM-1,菌株CS30754中blaSHv-12和blaTEM-1基因阳性.其余基因均为阴性.2株肺炎克雷伯菌PFGE分型可分为A、B两型.MLST显示,菌株CS11495、CS610和CS30754分别属于ST629、ST490及ST214,其中ST490为国内首次报道.结论 blaNDM-1阳性菌株具有广泛的耐药谱,与其同时携带多种耐药基因有关.尽管本地区不存在克隆传播,但分布于同一医院的不同科室,应预防其播散.
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鲍曼不动杆菌blaNDM-1基因序列分析及表达
目的 研究NDM-1鲍曼不动杆菌厦门分离株耐药性产生的分子机制.方法 Vitek32测定耐药谱.根据GenBank发表blaNDM-1基因序列设计合成引物,利用PCR技术扩增NDM-1鲍曼不动杆菌的blaNDM-1结构基因及其上下游调控序列片段,连接T载体,转化至大肠杆菌E.coli DH5α,序列测定并进行BLAST分析比对.测定始发菌株与重组菌株对美洛培南的小抑菌浓度.结果 药敏试验结果 显示,该菌株对碳青霉烯类及β-内酰胺类抗生素耐药.NDM-1鲍曼不动杆菌厦门分离株blaNDM-1基因与HK-01同源性为100%;与KP-05-506相比,在blaNDM-1和trpF之间有24 bp的插入.美洛培南小抑菌浓度测定结果 表明,重组菌株E.coli DH5α(pMD18-T::blaNDM-1)MIC值比始发菌株E.coli DH5α升高256倍.结论 获得blaNDM-1基因的大肠杆菌能够表达碳青霉烯酶,该基因是碳青霉烯类抗生素耐药性产生的分子基础,该基因具有跨种水平传播的可能.
关键词： NDM-1 鲍曼不动杆菌 blaNDM-1基因 序列分析 -
肺炎克雷伯菌质粒pNDM-LJ的高通量测序分析
目的：通过对肺炎克雷伯菌质粒pNDM-LJ的高通量测序分析，研究其与肺炎克雷伯菌耐药的相关性。方法：利用Illumina Miseq 高通量测序平台进行测序，然后用Edena 软件拼接测序数据，再利用RAST网上工具将拼接得到的contigs 进行注释，并用BLAST网上工具进行分析。结果：pNDM-LJ 为54 kb 大小的环状质粒，GC含量约为49％，预测编码52个功能基因，在不相容群分类中属于IncX3群质粒。该质粒与已知的IncX质粒序列有较高的相似性，blaNDM-1基因所在的基因环境比较复杂，推测其是由多个转座事件共同构建的。在pNDM-LJ中，blaNDM-1基因的5′端和3′端分别与ISAba125和IS26两种插入序列相连，形成大小约为10．8 kb的转座子样结构。结论：pNDM-LJ质粒携带碳青霉烯类耐药基因blaNDM-1，可能对我国的广泛传播blaNDM-1基因发挥重要作用。
关键词： 肺炎克雷伯菌 pNDM-LJ blaNDM-1基因 碳青霉烯酶 -
碳青霉烯类耐药雷氏普罗威登斯菌的出现及其耐药机制研究
目的 报告1株临床分离产NDM-1酶雷氏普罗威登斯菌FR90,研究其耐药机制.方法 对菌株进行药物敏感实验,改良Hodge实验检测金属β内酰胺酶,PCR扩增碳青霉烯水解酶基因.采用质粒接合实验、质粒不相容群检测、S1酶切脉冲场电泳和blaNDM-1杂交、基因测序等分析携blaNDM-1质粒特征和基因环境.结果 菌株FR90对氟喹诺酮类、多粘菌素B、β内酰胺类(包括碳青霉烯类)抗生素耐药,对氨曲南敏感.改良Hodge实验阳性,PCR检测几种常见碳青霉烯水解酶基因,结果仅blaNDM-1基因阳性.接合实验显示blaNDM-1基因位于一可接合性质粒上,质粒不相容群分型属于A/C型,Southern杂交结果显示质粒大小约为50 kb.对质粒上大小约为17 kb基因片段的测序结果示,ISAba125位于blaNDM-1基因两侧,下游依次为trpF、groS、groL基因和insE基因的一部分.结论 中国大陆出现临床分离产NDM-1酶雷氏普罗威登斯菌,警示我国需对产NDM-1细菌进行严密监测,并采取感染控制措施以阻断耐药基因在细菌之间传播.
关键词： 普罗威登斯菌 雷氏 金属β内酰胺酶 blaNDM-1基因 -
携带blaNDM-1基因的肠杆菌科细菌耐药流行特征分析
目的 了解昆明医科大学第一附属医院携带blaNDM-1基因的肠杆菌科细菌的分子流行特征.方法 收集昆明医科大学第一附属医院2011年12月-2014年10月临床送检的非重复标本,通过VITEK-2系统鉴定耐碳青酶烯类肠杆菌科细菌(CRE),EDTA协同纸片法进行金属酶表型确证,PCR技术检测blaNDM-1基因的携带情况,后采用ERIC-PCR技术分析菌株的同源性,明确待测菌株的耐药流行特征;结果 ①共收集到206株CRE菌株,产blaNDM-1的有42株(20.0％),其中以弗氏柠檬酸杆菌(43.0％)为主,主要分离自移植中心的尿液标本中;②药敏结果显示实验菌株均为多重耐药株,但磷霉素(5.4％)、阿米卡星(12.0％)和呋喃妥因(18.7％)等抗菌药物的耐药率相对较低;③金属酶表型确证的阳性率为95.0％;④ERIC-PCR结果显示弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌和大肠埃希菌在本院移植中心存在局部克隆播散;另外有4株分离自儿科的肺炎克雷伯菌电泳图谱相同.结论 本院携带blaNDM-1基因的肠杆菌科细菌高度流行,尤其是移植中心存在不同菌种的克隆播散型,应引起我们高度重视.
关键词： blaNDM-1基因 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌 同源性 -
30株CRE临床感染特点及blaNDM-1基因检出情况分析
目的 了解我院2013年4月—2014年3月临床分离的30株耐碳青霉烯类肠杆菌科(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)菌株blaNDM-1基因型检出情况,感染患者的临床特征,以及对常用抗菌药物的耐药特点.方法 临床分离菌株由美国BD公司生产的Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统进行菌株鉴定和药敏试验.改良Hodge试验检测产碳青霉烯酶,EDTA协同试验筛查金属β-内酰胺酶.利用特异性引物进行blaNDM-1基因PCR扩增,采用双脱氧末端终止法进行DNA测序,所测序列与GenBank基因库中的已知序列进行BLAST比对.结果 (1)菌株分布情况:我院2013年4月—2014年3月临床标本中分离出对碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌共30株,其中肺炎克雷伯菌16株,占53.3％;阴沟肠杆菌12株,占40.0％;布氏柠檬酸杆菌和弗氏柠檬酸杆菌各1株,blaNDM-1基因确证,共有5株为产NDM-1酶菌株,5株菌包括肺炎克雷伯菌2株,阴沟肠杆菌2株,布氏柠檬酸杆菌l株,这些细菌来自不同的科室,但主要分布在重症医学科(15/30,50.0％),神经内科重症病房(8/30,26.7％).标本主要来源于痰(20/30,66.7％),其次为尿液(5/30,16.7％),血液4株(13.3％),引流液1株(3.3％).5株产NDM-1酶菌株分离自4例患者,3株分离自患者尿液标本,2株分离自患者痰标本;感染患者平均年龄为73岁,平均住院时间10个月,2例死亡.(2)药物敏感性试验结果:30株CRE对碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为100％和86.7％,对其他β-内酰胺类抗生素耐药率均为100％;对氯霉素、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率在76.7％～93.3％之间;对多黏菌素和替加环素敏感率高达100％,其次为复方磺胺甲噁唑和阿米卡星,敏感率分别为66.7％和46.7％.5株产NDM-1酶菌株对多黏菌素和替加环素均敏感,3株对复方磺胺甲噁唑敏感,2株对阿米卡星敏感;而对β-内酰胺类抗生素以及喹诺酮类、氯霉素类等均耐药.结论 我院流行的CRE菌株主要分离自重症医学科和神经内科重症病房患者,对多种抗生素呈高度耐药,其中产NDM-1酶菌株主要来自长期住院的高龄患者,且死亡率较高,应对其感染的风险因素进行调查,并有针对性的采取感染预防措施进行防控.
关键词： 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 感染 blaNDM-1基因
