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抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性
目的分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链,并进行嵌合Fab复性的研究. 方法分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL.转化大肠杆菌后诱导其表达.大量制备表达的嵌合Fd 及嵌合轻链后,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性.然后,分别利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行分析和鉴定. 结果成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达,表达蛋白相对分子质量(Mr)均在24×103左右.表达量分别约占菌体总蛋白的28.3%和32.3%,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在.另外,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体,Mr约为42×103,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力.在起始总蛋白浓度为100μg/ml时,复性效率约为49%. 结论成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础.
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嵌合抗CD20 Fab诱导Daudi细胞凋亡
为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制,本研究采用竞争性免疫荧光抑制实验,证实抗CD20 Fab片段能竞争性抑制亲本鼠源性抗CD20单克隆抗体HI47和Daudi细胞CD20的结合.MTT法测定嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞生长的影响,结果显示嵌合抗CD20 Fab对Daudi细胞的生长具有抑制作用,抑制作用呈剂量依赖性,其IC50为69 μg/ml;利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20 Fab诱导细胞凋亡作用,结果显示嵌合抗CD20 Fab可诱导Daudi细胞凋亡,其凋亡率是Rituxan的2倍.这些实验结果证实嵌合抗CD20 Fab通过诱导Daudi细胞凋亡的机制抑制Daudi细胞生长.
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抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4人/鼠嵌合Fab抗体片段的制备及功能鉴定
目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定.方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列.将测序正确的鼠源VH、VL分别与人IgG1的CH1、CL通过Overlap PCR扩增Fd及全长L,再利用Overlap PCR以Fd和全长L基因为模板扩增cFab基因.将cFab基因片段克隆至载体pComb3XSS中构建表达载体pComb3XSS-Fab,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行蛋白可溶性表达.通过Western blot和ELISA方法对cFab抗体片段进行检测.结果:构建出抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab表达载体,Western blot结果证实在大肠杆菌Top10F'中表达出cFab可溶性抗体片段,ELISA结果显示cFab抗体片段与可溶性虫卵抗原(SEA)有较好的结合活性.结论:表达、纯化了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab抗体片段,cFab抗体片段具有与亲本抗体相同的抗原结合能力,为制备抗日本血吸虫人源化免疫毒素提供了技术贮备.
