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抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与序列分析
目的获得抗血管内皮生长因子165(VEGF165)抗体的轻重链可变区基因.方法从分泌具有中和抗血管内皮生长因子165活性的单抗杂交瘤细胞株VmD11中提取总RNA,经RT-PCR扩增并克隆该单抗的轻、重链可变区基因并进行序列分析.结果抗体的轻链可变区基因321 bp,属于小鼠第V亚群;重链可变区基因354 bp,属于小鼠第Ⅱ(B)亚群.结论所克隆的基因经核苷酸序列分析分别为抗体的轻、重链可变区基因.
关键词： 血管内皮生长因子165 可变区基因 RT-聚合酶链反应 核苷酸序列分析 -
抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析
目的克隆和分析抗汉滩病毒单克隆抗体(McAb)H7可变区基因.方法根据鼠源抗体可变区(V)氨基酸序列,设计合成一组抗体重、轻链可变区(VH/VK)简并引物.采用一步法提取McAb H7细胞总RNA,通过RT-PCR扩增V基因,并进行核苷酸序列测定和分析.结果通过RT-PCR成功克隆了H7可变区重轻链基因,序列分析表明均为开放阅读框,符合小鼠抗体框架结构,含有明确的4个骨架区和3个抗原决定簇互补区,与抗体二硫键形成有关的两个特征性半胱氨酸亦高度保守.同源对比表明,H7-VK长357 bp,编码119个氨基酸,属JK4重排;H7-VH长360 bp,编码120个氨基酸,属JH4重排.经GenBank查询证实为新基因,登记号为AY245601和AY245602.结论 McAb H7可变区基因的获得,为有目的地开展HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究奠定了基础.
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抗华支睾吸虫循环抗原噬菌体抗体基因分析
目的对获得的抗华支睾吸虫循环抗原Fab抗体克隆进行基因分析.方法将2株阳性克隆抗体基因进行测序,并用NCBI和Ig Blast Analysis of Immunoglobulin sequences中的分析软件,对其推导的氨基酸序列进行分析,再进一步模拟它们的二级结构.结果E38、B05阳性克隆抗体基因与人免疫球蛋白k轻链和γ重链可变区基因高度同源.推导的氨基酸序列均具有典型的抗体轻、重链可变区特征.用分析软件对推测的2株克隆轻链和重链Fd氨基酸序列进行二级结构模拟,结果显示以β-折叠和转角为主的平行肽链形成片层样结构,均符合抗体二级结构构型.结论E38、B05阳性克隆外源基因均属于人免疫球蛋白k轻链和γ重链可变区基因.
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抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达
目的:克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因并在原核细胞进行表达.方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和κ链的基因,重组到Fab表达载体中,在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab;根据前导肽序列设计引物,通过PCR介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列;以NIH3T3/erbB-2细胞ELISA法、免疫组化法等进行特异性鉴定.结果:以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和κ链的基因,在大肠杆菌中表达出Fab段抗体但无特异性抗原结合活性,分别将Fd段和κ链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后,恢复了Fab段的抗原结合活性.单独恢复Fd段可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性.但同时恢复κ链后活性却有所下降.结论:成功构建了抗p185小分子抗体Fab并进行功能性表达,为进一步构建抗p185鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础;进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性,为今后以PCR方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴.
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系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析
目的获取系列鼠抗人CD分子单抗的轻链及重链可变区基因并进行克隆和测序.方法采用RT-PCR技术,从WuT3、WuT4、WuTac、WuLCA、WuT9杂交瘤细胞总RNA中分别扩增出轻链和重链可变区基因,进行克隆并作核苷酸序列分析.结果以上几种抗体的轻重链可变区的PCR产物大小均为400bp左右,成功构建了pMD18-T-VL和pMD18-T-VH克隆载体,经限制性酶切分析,其大小与预期结果相符,并按ABI PRISM BigDye系统测序.结论经与Kabat、Blast抗体基因同源数据库比较,所获基因片段均为抗体基因.
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抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体的构建及表达
目的用基因工程抗体技术构建抗日本血吸虫膜蛋白特异的单链抗体.方法用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫膜蛋白特异性单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列.用VH和VL基因在pTHA90质粒载体中构建成单链抗体基因并诱导表达.结果扩增获得NP11-4的VH和VL基因,经测序分析确定为新发现的抗体可变区序列,构建成排列顺序为VH-linker-VL的单链抗体基因,经诱导表达出与硫氧环蛋白融合的单链抗体,大小约为36.2 kDa,以包涵体形式存在.结论成功地构建和表达了抗日本血吸虫膜蛋白特异性单链抗体.
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日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48可变区基因的克隆及序列分析
目的克隆日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48轻链及重链可变区基因并分析其序列.方法从杂交瘤细胞NP48提取总RNA、RT-PCR扩增目的基因片段,分别克隆于pMD18-T载体,测序并作核苷酸序列分析.结果 VL基因全长336 bp,属鼠免疫球蛋白κ链第Ⅱ亚类,由种系基因he24与Jκ4重排而来.该VL 基因序列已被GeneBank收录(accession No.AY309010).VH基因全长354 bp,属鼠免疫球蛋白重链第Ⅱ亚类, 由种系J558.47、Dsp2.2和JH4基因重排而来.该VH基因序列已被GeneBank收录(accession No.AY312433).结论序列比对分析表明该VL、VH基因为日本血吸虫单克隆anti-anti-id NP48可变区基因.
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抗日本血吸虫循环抗原噬菌体抗体基因结构分析
目的对获得的抗日本血吸虫循环抗原的抗体克隆进行基因分析.方法将2株阳性克隆抗体基因进行测序,并用NCBI和Ig Blast Analysis of Immunoglobulin sequences中的软件,对DNA序列和由其推导的氨基酸序列进行分析,并对其二级结构进行了模拟.结果B04和C24阳性克隆抗体基因的长度分别为708 bp和732 bp,轻链和重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白基因有高度的同源性.推导的氨基酸序列均具有典型的抗体轻、重链可变区特征.对2株克隆抗体基因二级结构进行模拟,结果显示以β-折叠和转角为主的平行肽链形成片层样结构,均符合抗体的基本构型.结论B04、C24阳性克隆外源基因均属于小鼠免疫球蛋白可变区基因.
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抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链基因的串联及克隆
目的制备抗日本血吸虫虫卵尿素溶性抗原单克隆抗体33F5 的基因工程单链抗体.方法利用杂交瘤细胞总mRNA抽提、逆转录技术及PCR 方法、获得单抗重链和轻链可变区基因,通过linker将其连接,并克隆到表达载体PCANTAB5E 中.结果酶切显示,重链和轻链可变区基因及ScFv片段与预设计的大小一致.结论获得抗日本血吸虫卵单抗33F5可变区轻、重链串联的基因克隆.
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抗人树突状细胞单克隆抗体可变区基因克隆和序列分析
目的:为了将抗树突状细胞(dendritic cells,DC)抗体应用于临床疾病治疗,计划克隆获得抗人DC单克隆抗体(McAb)的可变区序列,在此基础上进一步获得人源化的抗人DC抗体.方法:运用RT-PCR技术,从分泌抗人DC McAb的杂交瘤细胞株(H1E11)中,克隆出VH和VL基因片段,并对VH和VL进行了测序分析.所测得的重链和轻链在基因库中与相关的Ig的VH和VL基因序列进行经Blast同源性比较.结果:通过碱基和蛋白序列的比较确认为小鼠IgG的VH和VL基因.运用Dnasis软件对VH和VL基因进行阅读框分析和模拟翻译,并参照Kabat等人(1991)编写的Ig蛋白质编码序列图谱,根据其FRs和CDRs的序列特征进行Ig的家族分析,发现VH共有414 bp,编码138个氨基酸序列,属于小鼠IgG重链Ⅲ(A)家族;VL由396 bp编码,产生132氨基酸,属于轻链κV家族.结论:成功克隆抗人DC McAb重链和轻链的可变区.
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抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4人/鼠嵌合Fab抗体片段的制备及功能鉴定
目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定.方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列.将测序正确的鼠源VH、VL分别与人IgG1的CH1、CL通过Overlap PCR扩增Fd及全长L,再利用Overlap PCR以Fd和全长L基因为模板扩增cFab基因.将cFab基因片段克隆至载体pComb3XSS中构建表达载体pComb3XSS-Fab,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行蛋白可溶性表达.通过Western blot和ELISA方法对cFab抗体片段进行检测.结果:构建出抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab表达载体,Western blot结果证实在大肠杆菌Top10F'中表达出cFab可溶性抗体片段,ELISA结果显示cFab抗体片段与可溶性虫卵抗原(SEA)有较好的结合活性.结论:表达、纯化了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab抗体片段,cFab抗体片段具有与亲本抗体相同的抗原结合能力,为制备抗日本血吸虫人源化免疫毒素提供了技术贮备.
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抗华支睾吸虫循环抗原Fab抗体克隆的筛选及序列分析
目的获得抗华支睾吸虫循环抗原Fab段抗体.方法将华支睾吸虫代谢抗原包被在固相ELISA板中,采用"吸附-洗脱-扩增"的方法,对已构建的抗华支睾吸虫噬菌体抗体库进行富集.从富集后的抗体库中筛选抗循环抗原抗体克隆,并交叉筛选鉴定其特异性.结果从206个克隆中筛选到阳性克隆23个,再分别用肺吸虫、肝片虫、姜片虫和日本血吸虫脱脂全虫粗抗原进一步交叉筛选,终获得特异性抗Cs-MAg阳性克隆3个(B05,C10和E38).对其中2株(E38和B05)序列分析表明它们的κ轻链V基因属于人VκⅠ(O2)亚群,J基因属于Jκ1;γ链V基因属于人VHⅠ-69亚群,D基因来自D3-10,J基因则来自JH3.结论用成虫代谢抗原直接包板,可以从抗体库中筛选到阳性克隆,构建的噬菌体抗体库是成功有效的.
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抗人P185erbB2单抗C25的生物活性及其可变区基因的克隆
目的:了解抗人P185erbB2单抗C25的生物学活性,并克隆其可变区基因,为研制抗人P185erbB2的人源化抗体奠定基础.方法:以细胞ELISA、免疫组化等方法分析C25单抗的抗原结合特性,用MTT法检测其对乳腺癌细胞SKBR3、及卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用及对化疗药的增敏作用.经RT-PCR扩增C25单抗的轻、重链可变区基因,克隆后进行核苷酸序列分析.结果:C25单抗能特异结合人P185erbB2胞外区抗原,可显著抑制SKBR3、SKOV3细胞增殖,与顺铂具协同作用.抗体的轻链可变区基因327bp,属于小鼠κ轻链第Ⅲ亚群;重链可变区基因366bp属于小鼠IgG1第Ⅲ(A)亚群.结论:C25单抗可显著抑制人P185erbB2过表达肿瘤细胞的增殖并与顺铂具协同作用,所克隆的基因为抗体的可变区基因.
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抗组织蛋白酶B单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析
目的:为制备基因工程抗体,需要对组织蛋白酶B单抗可变区基因的核苷酸序列进行分析.方法:利用RT-PCR技术扩增2A2抗组织蛋白酶B单克隆抗体可变区基因,测序并和已报道的小鼠免疫球蛋白的基因库进行比较.结果:2A2抗组织蛋白酶B单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析及比较结果没有发现有害的基因突变.结论:2A2抗组织蛋白酶可变区基因可用于构建人鼠嵌合抗体.
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噬菌体基因工程抗体的制备与修饰
20世纪90年代兴起的噬菌体抗体库技术代表了当今基因工程抗体制备的前沿技术,PCR快速扩增可变区基因、噬菌体表面呈现技术(phage surface display)和大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子片段的成功是该技术得以发展的三大基石[1-3].1989年,Ward首次克隆了VH基因库[1];同年,Huse[3]首次构建了Fab抗体库,并用标记抗原筛选特异性抗体获得成功,此举开创了用噬菌体抗体库筛选单克隆抗体的先河.
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一株抗腮腺炎病毒Fab抗体克隆的筛选
[目的]获得抗腮腺炎病毒Fab段基因工程抗体.[方法]将腮腺炎病毒抗原(MUV-Ag)包被在固相ELISA板中,采用"吸附-洗脱-扩增"的方法,对已构建的抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库进行富集.从富集后的抗体中筛选抗腮腺炎病毒阳性克隆,并交叉筛选鉴定其特异性.[结果]在对176个克隆筛选后,再用麻疹病毒抗原(MEV-Ag)、混合副流感病毒抗原(mPIV-Ag)和呼吸道合胞病毒抗原(RSV-Ag)进行交叉筛选,终获得特异性抗MUV-Ag阳性克隆2个(B206和D210).对其中1株B206序列分析表明它的к轻链V基因属于VкⅠ(O12)亚群,J基因属于Jκ1;γ链V基因属于VH1-69 亚群,D基因来自D3-10,J基因则来自JH6.[结论]用腮腺炎病毒抗原成功地从抗体库中筛选到特异性阳性克隆,构建的噬菌体抗体库是有效的.
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抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗重链可变区基因克隆及序列分析
目的:从抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6中扩增克隆重链可变区基因.方法:采用PCR技术和基因工程技术,扩增杂交瘤细胞系2B12F6的重链可变区基因并克隆入载体pUC18,Sanger双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列.结果:重链可变区基因全长360 bp,编码118个氨基酸,其框架区与发表的小鼠重链可变区基因序列有70%的同源性,符合鼠重链可变区基因的结构特征.结论:抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ单抗杂交瘤细胞系2B12F6重链可变区基因的获得是构建抗变形链球菌SAⅠ/Ⅱ基因工程抗体的基础.
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抗人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体重链可变区基因的克隆和序列分析
目的:克隆并分析人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体重链可变区基因.方法:从分泌抗人VEGF单抗的杂交瘤细胞株(Ell)中提取总RNA,利用逆转录-PCR方法,克隆抗人VEGF单克隆抗体(MAB)重链可变区基因(VH),将其重组入pEGMR-T Vector测序载体测序.结果:VH基因序列全长369个碱基对,编码123个氨基酸,通过国际联机检索及Kabat库扫描证实,该VH基因符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,同源性高达87%.结论:VH基因全长369 bp,根据Kabat分类,归属小鼠重链可变区基因第Ⅱ(A)亚组,由VH-D-JH4重排产生.
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小鼠抗人S100A9单克隆抗体可变区基因克隆及其序列分析
目的 克隆小鼠抗人S100A9单克隆抗体(mAb)可变区基因并对其序列进行分析.方法 从分泌小鼠抗人S100A9mAb的杂交瘤细胞株(ⅡD4B10)中提取RNA,采用逆转录PCR扩增出轻链可变区基因VL和重链可变区基因vH,并对vL和VH进行克隆测序与BLAST同源性比较分析.结果 小鼠抗人S100A9 mAb VL基因编码区291 bp,编码97个氨基酸,属于IGKV14-111 *01家族;VH基因编码区324 bp,编码108个氨基酸,属于IGHV1-80* 01家族.所获取的vH和vL序列有明显抗体可变区特征,具有骨架区和互补决定区.结论 获得鼠抗人S100A9 mAb的重链和轻链可变区基因,为构建基因工程抗体奠定基础.
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抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达
目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达.方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGF scFv.将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性.结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL.SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27 000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性.结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础.
