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过量表达LMO2对成血管细胞增殖和造血分化的作用
目的 利用小鼠胚胎干细胞进行体外造血细胞分化,研究LMO2蛋白在成血管细胞分化过程中的作用.方法 构建小鼠成血管细胞特异性表达lmo2或绿色荧光蛋白的表达载体,分别转染小鼠胚胎干细胞.经过筛选获得细胞克隆进行自发分化以形成胚胎体.收集分化0～12 d的胚胎体细胞,检测造血细胞相关基因的表达;利用EB细胞进行细胞集落形成实验及血细胞集落形成单位实验,并统计集落形成数.结果 成功构建了成血管细胞特异性表达目的 基因的表达载体,转染目的 基因的小鼠胚胎干细胞在其分化中产生的成血管细胞可特异表达目的 基因.过量表达lmo2能够促进造血相关基因的表达,所产生细胞集落数是对照组的2倍,晚期造血分化的血细胞集落形成单位总数是对照组的2.5倍,其中红系集落单位数是对照组的3倍.结论 在成血管细胞中过量表达LMO2,促进其细胞增殖及其造血细胞分化.
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四氧嘧啶诱导的糖尿病对兔骨髓内皮祖细胞及循环内皮祖细胞功能的影响
目的 探讨糖尿病对兔骨髓内皮祖细胞(EPC)与循环EPC功能的影响,并观察骨髓EPC和循环EPC自体移植对糖尿病兔急性心肌缺血的改善作用.方法 四氧嘧啶法制造家兔糖尿病模型,8周后糖尿病兔分别抽取骨髓或外周血后于体外培养骨髓EPC及循环EPC,进行细胞鉴定并分别测定两种细胞的集落数、增殖力、黏附功能、成血管能力.糖尿病兔随机分为骨髓EPC组(n=6)、循环EPC组(n=6)及糖尿病对照组(n=6),并选取正常家兔作为正常对照组(n=6)进行细胞培养实验.骨髓EPC组、循环EPC组及糖尿病对照组兔制造急性心肌缺血模型后,分别心肌内自体移植骨髓EPC、循环EPC及培养液.4周后激光共聚焦显微镜观察移植细胞,Masson染色测定心肌纤维化面积,免疫组化法测定血管密度,超声心动图分析心功能的变化,实时定量PCR法测定血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的mRNA表达水平.结果 与正常对照兔比较,糖尿病兔循环EPC的集落数、增殖力、黏附力、成血管能力下降(均P＜0.05),骨髓EPC的集落数、增殖力、黏附力下降,但与正常对照兔比较差异均无统计学意义(均P ＞0.05),成血管能力较正常对照兔下降(P =0.023).与循环EPC组及糖尿病对照组比较,骨髓EPC组心肌纤维化面积较小(6.98％ ±0.94％比13.03％±2.97％、15.84％±4.74％,均P=0.001),血管密度[(792±87)比(528±71)、(372±77)条/mm2,均P ＜0.001]较大,VEGF(6.25 ±2.33比2.19±1.01、1.55±0.52,均P ＜0.001)及bFGF(6.38±2.65比1.24±0.76、1.18±0.82,均P＜0.001)的mRNA表达水平较高,左心室射血分数(61％±4％比47％±5％、50％±10％,均P＜0.05)较高.与糖尿病对照组比较,循环EPC组血管密度增加,但心肌纤维化面积、VEGF和bFGF的mRNA表达水平、左心室射血分数差异无统计学意义.结论 糖尿病损害了兔循环EPC功能,也影响了骨髓EPC成血管功能;糖尿病兔骨髓EPC自体移植可通过促血管新生及旁分泌作用减少心肌纤维化并改善心功能.
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特异性标记胚胎干细胞分化的成血管细胞
克隆小鼠flk1基因启动子和增强子,构建成血管细胞特异性表达GFP载体,并转染小鼠胚胎干细胞(ES).将ES分化形成胚胎体(EB),观察EB中GFP表达,收集第4天的EB细胞进行流式细胞分析和分选,以获得GFP+细胞进行血细胞集落形成实验,以确定GFP标记细胞造血分化潜能.结果显示,成功构建成血管细胞特异性表达GFP载体;转染的ES形成的EB中可见绿色荧光细胞.流式细胞分析结果发现,转基因组EB中的GFP+细胞(27.5%)与对照组EB中FLK1+细胞(28.1%)比较差异无统计学意义;GFP+和FLK1+细胞形成集落数比较差异无统计学意义.表明对ES分化产生的成血管细胞实现了特异性标记,为后续研究ES体外造血分化的分子机制奠定了基础.
