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抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体基因的构建、初步筛选和鉴定
目的: 构建抗木瓜凝乳蛋白酶全套单链抗体(scFv)噬菌体表面展示文库.方法: 从木瓜凝乳蛋白酶免疫小鼠的淋巴细胞中提取总RNA, 反转录成cDNA后, 用抗体V区简并引物扩增全套VH和VL基因.经重叠延伸反应, 装配成scFv基因, 并将其克隆到噬粒载体pFAB5C中, 构建scFv噬菌体抗体库.对抗体库进行亲和筛选后, 用ELISA法鉴定抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv.结果: 经4轮"亲和-吸附-洗脱"的富集过程, 得到ELISA活性较高可与木瓜凝乳蛋白酶结合的克隆.结论: 成功地构建了抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv噬菌体展示文库, 并筛选到与木瓜凝乳蛋白酶具有结合能力的scFv基因.
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人-鼠嵌合抗血小板单抗SZ-2 Fab片段基因的构建和表达研究
目的: 降低鼠源性抗血小板单克隆抗体SZ-2的免疫原性, 为其进一步研究、应用奠定基础.方法: 用Trizol试剂从SZ-2杂交瘤细胞抽提RNA, 应用RT-PCR技术, 扩增出SZ-2重链、轻链可变区基因, 克隆入载体pUCm-T, 测序分析.应用基因重组技术, 将SZ-2轻、重链可变区基因与人免疫球蛋白γ1重链CH1和κ轻链恒区基因进行拼接, 构建人-鼠嵌合Fab片段基因表达质粒pSW1-2 Fab/Hu, 并导入大肠杆菌XL1-blue诱导表达.以ELISA、Western blot和瑞斯托霉素诱导血小板聚集抑制试验, 对表达产物进行检测、验证.结果: 克隆的基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因的特征; 表达质粒pSW1-2 Fab/Hu拼接正确; 在大肠肝菌中的表达量约为180 μg/L; 表达产物具有与血小板GPIb结合的特性并可抑制瑞斯托霉素诱导血小板聚集.结论: 成功地克隆了SZ-2可变区基因; 并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体.
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抗血小板膜糖蛋白单抗SZ-21嵌合Fab片段基因的构建和表达研究
目的为降低抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-2l的免疫原性,克隆了SZ-21可变区基因,构建并表达人-鼠嵌合Fab基因工程抗体.方法利用基因克隆技术,从杂交瘤细胞系SZ-21克隆出轻、重链可变区基因,然后亚克隆到质粒pSW1中,构建成人-鼠嵌合Fab片段基因质粒pSZ-21,在大肠杆菌中表达.结果 pSZ-21基因构建正确,在大肠杆菌中表达出可溶性抗体片段,表达产物具有与血小板结合的活性.结论成功地克隆了SZ-21可变区基因,并表达了可溶性人-鼠嵌合Fab基因工程抗体.
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具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析
目的利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5,克隆其mAb体的可变区基因.方法提取杂交瘤细胞的总RNA,分离mRNA,反转录合成cDNA.经PCR扩增VH基因和VL基因,将VH基因和VL基因与载体pGEM-T连接后,进行酶切鉴定和序列分析.结果构建了2个分别含有VH和VL基因的重组质粒.序列分析表明,VH和VL分别属于ousc heavy chain subgroupIII和mouse light chain subgroupV亚群,长度为372和324bp,编码124和108个氨基酸,在高变区分别有4和2个丝氨酸.结论克隆的VH和VL基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征,为将来制备具有GPX活性的单链抗体提供了可靠的基因材料.
