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腺病毒介导的线粒体融合素基因-2诱导大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞凋亡
目的研究腺病毒介导的线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,Mfn2)对大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)凋亡的影响.方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,用携带大鼠Mfn2基因(rMfn2)的重组腺病毒Adv-rMfn2-GFP和含有绿色荧光蛋白基因的对照腺病毒Adv-GFP分别感染球囊损伤动脉段,以磷酸缓冲液(PBS)作为未感染对照组,假手术组作为正常对照组,采用免疫组织化学方法检测外源基因表达水平;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞;Image-Pro图像分析系统进行血管定量组织形态学分析.结果病毒感染后5 d,免疫组织化学证实Adv-rMfn2-GFP组Mfn2蛋白表达水平明显;TUNEL染色显示,Adv-rMfn2-GFP组的VSMCs凋亡率明显高于PBS组和Adv-GFP组,假手术组未见TUNEL阳性VSMCs (n＝10,P<0.01);感染后21 d,Adv-rMfn2-GFP组的血管内膜面积及内膜/中膜面积比明显低于对照组(n＝10, P<0.01).结论高表达Mfn2基因可诱导大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞凋亡.
关键词： 线粒体融合素基因-2 血管平滑肌细胞 凋亡 腺病毒科 基因治疗 -
线粒体融合素基因-2对人骶韧带成纤维细胞增殖及功能的影响
目的：研究外源性线粒体融合素基因-2（Mfn2）表达对骶韧带成纤维细胞的增殖及其合成前胶原蛋白功能的影响。方法：取新鲜骶韧带组织，用组织块法在体外培养出成纤维细胞。将第2～4代细胞分组：转染LV-Mfn2-GFP组（Mfn2＋组），转染LV-GFP组（Mfn2-组）和未转染组（对照组）。流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白（GFP）表达，RT-PCR和Western blot检测Mfn2表达。细胞计数和cck-8法检测Mfn2对细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞周期分布。RT-PCR和Western blot检测细胞前胶原1 A1/1A2/3A1的表达。结果：转染慢病毒的成纤维细胞GFP蛋白表达率73.2％～79.1％，转染Mfn2＋组成纤维细胞稳定高表达Mfn2蛋白，显著高于Mfn2-组和对照组（P＜0.05，both）。cck-8实验提示，转染表达Mfn2基因96h后，成纤维细胞增殖明显受到抑制，Mfn2＋组细胞数显著低于 Mfn2-组和未转染组（P＜0.05 both）；DNA直方图分析法测定显示转染Mfn2基因的细胞大部分停滞于G0/G1期，Mfn2＋组G0/G1期细胞比例（60.7％±3.26％），显著高于 Mfn2-组（43.2％±3.32％）和对照组（40.8％±2.28％），（P＜0.05， both）。半定量RT-PCR和Western blot示Mfn2＋组成纤维细胞合成表达前胶原1A1/1A2/3A1显著低于Mfn2-组和对照组（P＜0.05，all）。结论：Mfn2基因在体外转染成纤维细胞后，抑制细胞增殖并使成纤维细胞前胶原蛋白表达下降，可能是导致骶韧带细胞外基质减少，影响韧带纤维数量和质量的重要原因。
关键词： 线粒体融合素基因-2 成纤维细胞 前胶原蛋白 增殖 细胞周期 -
线粒体融合素基因-2与肿瘤
线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,Mfn-2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,在维持线粒体的形态、功能等方面起着重要作用.随着研究的不断深入,Mfn-2在细胞信号转导、能量代谢、增殖及凋亡等生命过程中的作用日益显现.而肿瘤发生与细胞过度增殖及凋亡不足等密切相关,因此,如何抑制肿瘤细胞的过度增殖和促进细胞凋亡已成为目前的研究热点.Mfn-2通过多条通路参与多种肿瘤传代细胞系的增殖和凋亡,其表达异常或功能缺失可能是肿瘤发生、发展的重要原因.Mfn-2在许多肿瘤组织中低表达,且表达情况与肿瘤病理类型及生物学行为密切相关,提示其有可能是新的抑癌基因;同时,Mfn-2过表达与喜树碱、放线菌酮(cycloheximide,CHX)等化疗药物联用具有协同作用,提示具有成为化疗增敏靶点的潜力.本文就Mfn-2的功能与肿瘤发生、发展的关系及其治疗学意义的相关研究进展进行综述.
关键词： 线粒体融合素基因-2 肿瘤 信号通路 基因治疗 -
线粒体融合素基因-2启动子区域甲基化与食管鳞状细胞癌的关系研究
[目的]检测食管鳞状细胞癌线粒体融合素基因-2 (mitofusion2,Mfn2)基因启动子区域甲基化的情况,探讨其相关的临床意义.[方法]选取2014年2月～2016年3月我院收治的食管鳞状细胞癌患者116例组织蜡块,另取同期我院因食管良性病变切除的食管组织40例为对照组.Mfn2基因启动子区域甲基化使用亚硫酸盐修饰后PCR检测.[结果]食管鳞癌患者中Mfn2基因启动子区域甲基化率为37.1％(43/116),显著高于对照组的16.4％(19/116)(P＜0.05).食管鳞癌患者男女性别和不同年龄之间Mfn2基因启动子区域甲基化率差异无统计学意义(P＞0.05).T3、T4临床分期患者Mfn2基因启动子区域甲基化率为46.2％(24/52),显著高于T1、T2临床分期患者的29.7％(19/64)(P＜0.05).有淋巴结转移患者Mfn2基因启动子区域甲基化率为44.4％(28/63),显著高于无淋巴结转移患者的28.3％ (15/53) (P＜0.05).肿瘤中、低分化患者Mfn2基因启动子区域甲基化率44.3％(31/70),显著高于高分化患者的26.1％(12/46)(P＜0.05).[结论]Mfn2基因启动子区域在食管鳞癌组织中高甲基化,Mfn2基因启动子区域高甲基化与食管鳞癌的临床分期、肿瘤分化程度以及有无淋巴结转移密切相关.
关键词： 食管鳞状细胞癌 线粒体融合素基因-2 甲基化 -
线粒体融合素-2对裸鼠成瘤性及增殖、转移的影响
目的 观察线粒体融合素(mfn)-2对裸鼠成瘸性及增殖瘤的增殖、转移的影响.方法 裸鼠共分为3组:实验组、空载体对照组、空白对照组,分别将3组MCF-7细胞异种移植到无胸腺小鼠体内.建立裸鼠人乳腺癌移植瘤模型,比较3组裸鼠之间肿瘤的大小和重量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测3组肿瘤组织mfn2的表达,免疫组织化学半定量检测核增殖抗原(Ki-67)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 实验组、空载体对照组、空白对照组3组肿瘤瘤体质量(单位:g)分别为1.78±0.13、2.84±0.16、2.77±0.12,实验组裸鼠肿瘤重量明显低于对照组(P<0.05),实验组瘤体的体积与两对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),实验组mfn2基因高表达(P<0.05),两对照组低表达,两对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),实验组与两对照组比较,实验组Ki-67的表达升高,而VEGF的表达明显降低(P<0.05).结论 mfn2基因可明显抑制人乳腺癌成瘤,对人乳腺癌裸鼠移植成瘤后的增殖和转移能力有影响.
关键词： 线粒体融合素基因-2 成瘤 基因治疗 -
线粒体融合素基因-2对乳腺癌细胞RECK基因表达的影响
目的 探讨线粒体融合素基因-2(mfn2)对乳腺癌细胞株MCF-7细胞中RECK表达的影响.方法 利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFP-mfn2转染MCF-7细胞.RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因mRNA的转录水平;Weastern blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达.结果 转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达mfn2,RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达,转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高.结论 mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达.
关键词： 线粒体融合素基因-2 MCF-7 RECK -
Mfn2介导缬沙坦抑制血管平滑肌细胞增殖的研究
目的 研究缬沙坦对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响,并探讨其新的作用机制.方法 体外培养VSMCs,采用AngⅡ诱导其增殖,用不同浓度的缬沙坦(10-5、10-6、10-7mol/L)进行干预,细胞计数及四氮唑盐试验(MTT)检测VSMCs增殖情况,Western blot检测各组线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)、Raf、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinase 1/2,ERK1/2)表达水平的变化.结果 AngⅡ能够明显促进VSMCs的增殖,下调Mfn2的表达、增强Raf和ERK1/2的表达;缬沙坦10-5、10-6mol/L可以拮抗AngⅡ的上述作用,而缬沙坦10-7mol/L无此作用;缬沙坦对无AngⅡ刺激的VSMCs增殖无明显影响.结论缬沙坦能有效抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖,其机制与调节Mfn2的表达、抑制Ras-Raf-ERK/MAPK信号通路有关.
关键词： 缬沙坦 血管紧张素Ⅱ 血管平滑肌细胞 增殖 线粒体融合素基因-2 -
Mfn2基因抑制Ras-PI3K-Akt信号途径并诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡
目的 应用腺病毒介导的转基因技术,研究过表达线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,Mfn2)对WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞(rVSMCs)凋亡的影响并探讨其相关的信号通路.方法 体外培养rVSMCs,感染含有Mfn2基因的腺病毒载体(Adv-Mfn2-GFP).通过免疫组化染色显示细胞凋亡的形态学特征;采用琼脂糖凝胶电泳,Cell Death ELISA观察过表达Mfn2基因对细胞凋亡的影响;用Western blot检测感染Mfn2基因后不同时间点的磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)水平的变化.结果 rVSMCs感染Adv-Mfn2-GFP后能有效表达出相应蛋白;过表达Mfn2基因能明显促进rVSMCs凋亡,并抑制ET-1诱导的Akt活化和ERK活化,此作用显示出时间依赖性,且Akt活化受到的抑制更明显.结论 过表达Mfn2基因能明显促进WKY大鼠主动脉血管平滑肌细胞凋亡,其分子机制是抑制Ras信号途径的活化,分子作用靶点可能是Ras-PI3K-Akt信号通路.
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mitofusin-2对乳腺癌细胞RECK基因表达及MMPs活性的影响
目的 探讨线粒体融合素基因-2(mitofusin-2)对乳腺癌MCF-7细胞株中RECK表达及MMP-9,MMP-2活性的影响.方法 利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFPmfn2转染MCF-7细胞.RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因mRNA的转录水平;Weastem Blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达;明胶酶谱试验检测转染前后MMP-9及MMP-2的活性.结果 转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达Mfn2;RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达;转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高,且MMP-9及MMP-2的活性显著降-低(P＜0.05).结论 mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达,并显著抑制其MMP-9及MMP2的活性.该途径可能是mfn2基因抗肿瘤作用的新机制.
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线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响
背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖.本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响.方法:将含有mfn2 cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Western blot法检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化.结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP.MTT实验提示转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2 cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2+2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P＜0.05).mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4 h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6+4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4+2.8)%(P＜0.05).结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性.
关键词： 乳腺肿瘤 线粒体融合素基因-2 MCF-7细胞 细胞增殖 药物敏感性 -
线粒体融合素-2对裸鼠移植瘤Ki-67、血管内皮生长因子的影响
目的:探讨瘤内注射vivo-jetPETTM/pEGFP Mfn2复合物对裸鼠移植瘤增殖的影响.方法:质粒pEGFPMfn2的构建及检测,将MCF-7细胞异种移植到裸鼠体内,建立人乳腺癌移植瘤模型,用vivo-jetPEITM试剂制备vivo-jetPEITM/DNA复合物,实验共分为实验组、空载体对照组和空白对照组.瘤内多点注射,RT-PCR检测肿瘤组织线粒体融合素-2(Mfh2)的表达,免疫组化检测Ki-67、血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况.结果:pEGFP Mfn2构建成功并测序证实,实验组的相对平均吸光度值为(1.12±0.05)高于空载体对照组的(0.16±0.05)和空白对照组(0.17±0.07)(P<0.05),Ki-67在实验组的相对平均吸光度为(0.25±0.06)高于空载体对照组的(0.11±0.02)和空白对照组(0.12±0.03)(P<0.05),而VEGF在实验组的相对平均吸光度为(0.09±0.01)低于空载体对照组的(0.14±0.08)和空白对照组的(0.13±0.03)(P<0.05).结论:vivo-jetPEITM试剂能成功将Mfn2基因转染进瘤体细胞,Mfn2基因对人乳腺癌裸鼠移植成瘤后的Ki-67和VEGF有影响.
关键词： 肿瘤 血管内皮生长因子A 线粒体融合素基因-2 基因治疗 -
Mfn2基因过表达对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及EGFR、EGF蛋白表达的影响
目的 通过使人乳腺癌MCF-7细胞过表达线粒体融合素基因-2(Mfn2),研究外源性Mfn2基因对MCF-7细胞增殖及对表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)蛋白表达的影响.方法 实验分为对照组、转染空质粒pEGFP-N1组、转染Mfn2质粒的pEGFP-Mfn2组.转染48 h后,检测各组细胞的转染效率、Mfn2mRNA及Mfn2蛋白表达.检测各组MCF-7细胞增殖情况、各组MCF-7细胞周期分布情况.同时检测各组EGFR及EGF蛋白表达情况.结果 转染48 h后pEGFP-N1组及pEGFP-Mfn2组转染效率分别为(49.15±2.04)％及(51.10±2.18)％,高于对照组[(0.58±0.21)％,P＜0.05];pEGFP-Mfn2组的Mfn2 mRNA及Mfn2蛋白表达均显著高于对照组及pEGFP-N1组(P＜0.05);pEGFP-Mfn2组MCF-7细胞增殖抑制率显著高于其余两组(P＜0.05),细胞周期主要阻滞于G0/G1期;pEGFP-Mfn2组EGFR和EGF蛋白表达水平显著低于其余两组(P＜0.05).结论 Mfn2基因过表达可显著抑制MCF-7细胞增殖,其机制可能与Mfn2基因过表达导致了EGFR及EGF表达下调有关.
