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玉米赤霉烯酮对MCF-7和T47D细胞凋亡的抑制作用
玉米赤霉烯酮(ZEA)是一种霉菌毒素[1],在奶制品及霉变谷类食物中含量较高.据报道,ZEA在结构上与内源性雌激素有相似之处,通过与雌激素受体结合而模拟雌激素效应,增加女性体内雌激素负荷,与乳腺癌发病率的升高有关[2].本实验室前一阶段的研究表明[3],ZEA可模拟雌激素作用,促进雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7及T47D细胞增殖,促进细胞DNA合成,并推进细胞进入S期和G2/M期,是一种有效的促有丝分裂因子.本次实验集中探讨ZEA的这一作用是否与细胞的凋亡现象有关.
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苦参碱对MCF-7细胞Fas、VEGF及端粒酶活性的影响
目的 研究苦参碱对人乳腺癌MCF-7细胞Fas、VEGF及端粒酶活性的影响.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,随机分组,实验组细胞加入苦参碱溶液,对照组或阴性对照组细胞加入等量培养液,阳性对照组细胞加入端粒酶抑制剂莪术油.采用倒置显微镜下观察细胞形态学变化;TRAP-ELISA法检测端粒酶活性;免疫细胞化学法检测MCF-7细胞中Fas、VEGF蛋白表达情况.结果 苦参碱对乳腺癌细胞有明显的生长抑制作用和促凋亡作用;不同浓度苦参碱处理MCF-7细胞24、48、72 h后,端粒酶活性随苦参碱浓度增加和作用时间延长而逐渐下降,呈剂量-效应正相关和时间-效应正相关;苦参碱能够上调MCF-7细胞Fas蛋白表达和下调MCF-7细胞VEGF蛋白表达.结论 苦参碱对MCF-7细胞具有明显的生长抑制作用和促凋亡作用,可能是通过上调Fas蛋白表达、抑制端粒酶活性诱导乳腺癌细胞凋亡及通过下调VEGF蛋白表达,抑制肿瘤血管形成等实现的.
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RNA干扰RSK4基因表达对裸鼠移植瘤生长与转移影响观察
目的:应用慢病毒干扰载体(RSK4-RNAi-LV)干扰RSK4基因在乳腺癌细胞株MCF-7中的表达,研究RSK4基因被干扰后对裸鼠移植瘤生长及转移的影响.方法:将转染了siRNA(RSK4-RNAi-LV)的MCF-7细胞组(实验组)、转染了siRNA(NC-GFP-LV)的MCF-7细胞组(阴性对照组)和未转染的MCF-7细胞组(空白对照组)分别接种至裸鼠乳腺脂肪垫下,建立裸鼠移植瘤模型,观察每组裸鼠移植瘤生长情况;应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测3组移植瘤组织中RSK4 mRNA及其蛋白的表达;HE染色观察3组裸鼠内脏转移情况.结果:实验组的移植瘤平均体积为(2 264.08±367.47) mm3,明显大于阴性对照组(843.67±318.13) mm3及空白对照组的(720.45±241.35) mm3差异有统计学意义,F=112.425,P=0.02;实验组瘤体平均体质量为(1.44±0.25)g,明显重于阴性对照组(0.73±0.20)g及空白对照组的(0.70±0.21)g,差异有统计学意义,F=89.54,P=0.01.实验组裸鼠移植瘤肺转移6只,空白对照及阴性对照组各1只.实验组肿瘤组织RSK4 mRNA的相对表达量为0.140±0.843,明显低于阴性对照组的1.000±0.000(P=0.008)和空白对照组的0.878±0.689(P=0.005).实验组、阴性对照组和空白对照组RSK4蛋白的表达量分别为0.138±0.023、0.532±0.032和0.465±0.057,3组间差异有统计学意义,F=73.1,P=0.003;实验组RSK4蛋白表达量明显低于阴性对照组(P=0.006)和空白对照组(P=0.012).结论:慢病毒干扰MCF-7细胞中RSK4基因表达能促进MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长及转移.
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体外共培养研究乳腺癌细胞株MCF-7对正常内皮细胞的作用
目的在体外共培养体系中研究乳腺癌细胞对正常内皮细胞的作用.方法建立乳腺癌细胞株MCF-7与正常内皮细胞的体外共培养体系条件培养液Z-MCF-7-EC;以同期单独培养的正常内皮细胞为对照,对与乳腺癌细胞株MCF-7在Z-MCF-7-EC条件下共培养后的内皮细胞进行透射电镜细胞超微结构、光镜细胞形态学观察,并以看家基因β2m为内参照进行ESM、IGFBP-3、αvβ3、VE-C、及Tie-2-2基因半定量RT-PCR表达分析,以缩时录像技术进行血管新生观察.结果与同期单独培养的正常内皮细胞对照相比,经共培养后的内皮细胞形态不规则、呈游走状;超微结构出现胞核增大、核仁增大、核浆比例增大,内质网疏松、变形,细胞表面窗孔加深,细胞间隙加大和细胞表面纤毛减少;半定量RT-PCR值均较对照上调,其半定量值与对照组比较:ESM/β2m (0.60±0.28,P<0.01)、IGFBP-3/β2m (0.54±0.30,P<0.05)、αvβ3/β2m (0.58±0.23,P<0.01)、VE-C/β2m (0.51±0.17,P<0.01)及Tie-2-2/β2m (0.55±0.21,P<0.05).结论共培养后的内皮细胞有明显的趋瘤特征和血管新生能力,推测活体内乳腺癌生长中通过对相邻内皮细胞的作用促进血管新生且新生血管的内皮细胞性质与行为不同于正常内皮细胞.
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邻苯二甲酸二丁酯的拟雌激素活性研究
目的探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的拟雌激素活性.方法对雌激素敏感的人乳腺癌MCF-7细胞在RPMI1640培养基中采用开放式单层贴壁培养,开始实验前将细胞用PBS洗涤后改为在无酚红RPMI 1640培养基中培养5 d,实验设溶剂对照、雌激素阳性对照和邻苯二甲酸二丁酯各剂量组(10-7～10-3mol/L),采用四唑盐(MTT)法、生长曲线、有丝分裂指数和细胞克隆形成试验对MCF-7细胞增殖情况进行分析.结果与溶剂对照组相比,10-5mol/L DBP处理24 h就可促进MCF-7细胞增殖,提高增殖指数;随着培养时间延长至96 h,其他浓度DBP也表现出促进细胞增殖的效果,且浓度在10-5 mol/L时,细胞增殖活性达到大;在对数生长期,DBP可提高MCF-7细胞的有丝分裂指数;10-5 mol/L DBP处理48 h就可增强MCF-7细胞形成细胞克隆的能力.结论邻苯二甲酸二丁酯可促进雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞的增殖,可能具有拟雌激素作用.
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植物雌激素对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响
目的: 探讨植物雌激素大豆异黄酮(genistein,GS)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响. 方法: 雌激素依赖性MCF-7细胞在DMEM培养液(含小牛血清10%)中采用开放式单层贴壁培养,于加受试物前5 d将细胞用PBS洗涤后改为无酚红高糖DMEM(含5%经活性碳-葡聚糖苷处理的胎牛血清,CDT-FBS)培养,实验设溶剂对照、雌激素对照、抗雌激素对照及两种受试物各四个剂量组,采用噻唑蓝(MTT)法、3H-TdR掺入法及流式细胞术对MCF-7细胞的增殖情况进行分析. 结果: 与溶剂对照组相比较,GS(96 μmol/L,24 h)可明显抑制MCF-7细胞增殖和细胞DNA合成,并将细胞周期阻滞在G2/M;8 μmol/L GS处理96 h也能产生类似的抑制效果.96 nmol/L ZEA处理24 h可明显促进MCF-7细胞增殖和细胞DNA合成,并将细胞周期由G0/G1向S期推进,提高细胞分裂增殖指数. 结论: ZEA和GS均属环境雌激素,但对乳腺癌细胞MCF-7增殖产生的影响不同,ZEA可促进MCF-7增殖,而GS能够抑制MCF-7细胞的增殖,即GS具有用于癌症预防及有关保健食品开发的价值.
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BALB/C小鼠MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌移植模型的建立和评价
目的 建立BALB/C小鼠MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌移植模型,并比较二者的生物学与形态学特征.方法 20只BALB/C小鼠随机分为两组,每组10只.将MCF-7和MDA-MB-231细胞悬液分别接种于两组裸鼠腋下,制作小鼠原位乳腺癌模型.比较两组的成瘤时间、成瘤率、肿瘤生长速度、肿瘤形态、肿瘤的组织学表现、远隔转移情况、ER和PR表达.结果 两组的接种成功率均为100％.MDA-MB-231组于接种后14 d左右成瘤,MCF-7组约10d左右成瘤.两组的生长曲线相似.第8周时MDA-MB-231组肿瘤体积[(3.204±0.157) cm3]大于MCF-7组[(2.912±0.312) cm3],差异有统计学意义(t=2.642,P＜0.05);MDA-MB-231组远隔转移高于MCF-7组.两组的病理结果均为浸润性导管癌.MDA-MB-231组的ER、PR表达均为阴性,MCF-7组的ER和PR表达均为阳性.结论 2种细胞系所建立的的乳腺癌移植型裸鼠模型均较理想,基本保持了人乳腺癌细胞的生物学特性.
关键词： 乳腺癌 动物模型 MDA-MB-231细胞株 MCF-7细胞株 -
罗格列酮5-Aza干预乳腺癌MCF-7细胞系体外培养的效应
目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮(罗格列酮)联合甲基转移酶抑制剂5-脱氧氮杂胞苷(5-Aza-cdR)对雌激素受体阴性的人乳腺癌细胞株MCF-7体外培养的抑制作用,为临床靶向治疗乳腺癌提供基础试验依据.方法:取对数生长期生长良好的乳腺癌MCF-7细胞株,按2.0×106细胞/孔接种24孔板,按析因试验设置试验组.采用MTT比色法观察罗格列酮和5-氮胞苷对体外培养的MCF-7细胞株生长的抑制作用;用倒置光学显微镜观察MCF-7细胞用药前后的形态学变化;应用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化.结果:罗格列酮组、5-氮杂胞苷组和联合组均能有效的抑制MCF-7细胞生长(P<0.05).3组的细胞抑制率随着时间的延长而增加.在72h时点,罗格列酮组、5-氮杂胞苷组、联合组和对照组的早期凋亡百分率分别为36.9%、22.7%、35.5%、24.1%,晚期凋亡百分率分别为16.0%、43.7%、37.7%、40.2%;3组的G0、G1期(DNA合成前期)细胞分别为81.3%、67.3%、74.5%和6.0%;S期(DNA合成期)细胞分别为2.5%、17.1%、0和38.5%.G2期(DNA合成后期)细胞分别为16.3%、15.6%、25.5%和55.4%.与对照组相比3组G0、G1期的阻滞作用均较强(P<0.05),联合用药未增强G0、G1期的阻滞作用(P<0.05).结合分析细胞凋亡实验结果,联合用药既不增强周期阻滞效果未增强凋亡效果(P<0.05).结论:体外培养抑制试验证明罗格列酮、5-Aza均能有效的抑制乳腺癌细胞株MCF-7的生长.罗格列酮对MCF-7细胞株的干预作用是通过周期阻滞完成的,5-氮胞苷能干预细胞周期,其可能的机制是诱导细胞成熟分化.
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金雀异黄素对人乳癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响
目的:采用离体细胞培养的方法,研究大豆异黄酮的主要成分金雀异黄素(GEN)对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用及其作用机理.方法:MCF-7细胞接受不同浓度的GEN处理,MTT比色法测定GEN抑制MCF-7细胞的量效关系;细胞分裂指数试验用于评价GEN对该细胞的恶性增殖的抑制作用;细胞形态学观察及原位细胞凋亡检测法(TUNEL)用于检测细胞凋亡.结果:GEN的IC30与IC50分别为17.5μmol/L及32.0 μmol/L,GEN对MCF-7具有明显的抑制作用,且该抑制作用呈剂量反应关系;各剂量GEN均可抑制MCF-7细胞分裂并且呈剂效关系;细胞形态学观察及TUNEL检测发现GEN处理48 h及96 h后有明显的凋亡细胞出现,并呈现剂效关系,而本次实验未发现其时效关系.结论:GEN可抑制离体培养MCF-7细胞的增殖,其作用机理可能与GEN诱导细胞凋亡的途径有关.
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环境雌激素对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡作用的影响
[目的] 通过观察对-壬基酚(nonylphenol,NP)、双酚A(bisphenol A,BisA)和邻苯二甲酸二丁酯(dibutylphthalate,DBP)对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响,探讨环境雌激素促进MCF-7细胞增殖的生物学机制.[方法] 将在DMEM培养液(含10%小牛血清)中的MCF-7细胞采用开放式单层贴壁培养,加受试物前5 d将培养细胞用PBS洗涤后改为在无酚红DMEM(含5%经活性碳-葡聚糖苷处理的胎牛血清,CDT-FBS)中培养连续5 d,其目的是耗尽细胞内储存的雌激素.实验设溶剂对照组、雌激素对照组、抗雌激素(它莫西芬)对照组及三个实验组,采用流式细胞术、DNA片段凝胶电泳和细胞苏木素染色(HE),观察环境雌激素对雌激素耗尽所诱导的细胞凋亡作用的影响.[结果] 3.2×10-6 mol/L NP和3.2×10-5 mol/L BisA对MCF-7细胞处理72 h,与对照组相比,流式细胞仪分析结果表明,二倍体细胞(G1期细胞)明显增加,亚二倍体细胞峰(即细胞凋亡率)消失,DNA凋亡片段凝胶电泳不显示典型的凋亡DNA片段梯带,细胞苏木素染色结果也显示凋亡细胞明显减少.[结论] 与溶剂对照组相比,NP和BisA均能够抑制MCF-7细胞的凋亡作用,而3.2×10-4 mol/L DBP对细胞凋亡的影响作用不明显.这一结果提示,该类物质有可能是通过抑制细胞凋亡而发挥其促进MCF-7细胞增殖作用的.
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鱼藤素对乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响
目的:观察鱼藤素对MCF-7细胞株细胞增殖和凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B (phosphatidvlinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路的影响,旨在研究其抗肿瘤机制.方法:细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK8)检测0、1、5、10、15和20μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72 h后对MCF-7细胞增殖的影响,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡率,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态,蛋白质印迹法检测细胞内PI3K/Akt通路相关分子的蛋白表达.结果:5、10、15和20 μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72 h后能明显抑制MCF-7细胞增殖(P＜0.01),抑制率随着浓度升高和时间延长而增加,各组间两两比较差异有统计学意义(P＜0.05);而1μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72 h后对MCF-7细胞的增殖无明显影响(P＞0.05).5、10、15和20 pmol/L鱼藤素作用6 h后能诱导MCF-7细胞凋亡,透射电子显微镜下可观察到典型的凋亡细胞形态,而相同条件下1μmol/L鱼藤素对MCF-7细胞的凋亡诱导作用不明显.5μmol/L鱼藤素作用6 h后,MCF-7细胞内磷酸化Akt(p-Akt)(Thr308)、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β)(Ser9)、磷酸化磷酸肌醇依赖性激酶1(phosphorylated 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1,p-PDK1)(Ser241)和磷酸化人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因编码的蛋白(phosphorylated phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,p-PTEN)(Ser380)的表达量明显减少,而总Akt蛋白的表达量则无明显变化;1μmol/L鱼藤素作用6 h后,细胞内上述所有蛋白的表达量均无明显变化.结论:鱼藤素可能通过抑制PTEN(Ser380)和PDK1(Ser241)蛋白的磷酸化,进而抑制Akt(Thr308)的磷酸化,间接抑制其下游GSK-3β(Ser9)的磷酸化,终诱导MCF-7细胞凋亡和抑制其增殖.
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不同CO2分压对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响
目的:观察不同CO2分压对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响,探讨临床腔镜技术的安全性.方法:体外建立人工气腔,MCF-7细胞在0、7、15 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)CO2分压下暴露l h,处理后0、24、48、72 h测定细胞增殖率,FCM(流式细胞术)测定MCF-7细胞凋亡率和Fas、Fas-L表达.采用0 mmHg的N2(1 h)作为缺氧对照组;正常培养细胞作为正常对照组.结果:与正常对照组相比,0 mmHg CO2可促进MCF-7细胞增殖(P＜0.05),7、15 mmHg CO2抑制细胞增殖(P＜0.05);7、15 mmHg CO2组细胞凋亡率明显增高(P＜0.05);15 mmHg CO2组MCF-7细胞Fas表达明显增高(P＜0.05);7 mmHg CO2组Fas表达在处理后0 h时增高(P＜0.05);7、15 mmHg CO2组在处理后24、48 h Fas-L表达显著增高(P＜0.05).结论:CO2分压对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响较复杂,临床常用的7~15 mmHg CO2分压能增加肿瘤细胞Fas/Fas-L表达,抑制增殖,促进凋亡.
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靶向VEGF基因siRNA对放射性核素杀伤肿瘤的增强作用
目的建立特异性靶向VEGF基因表达的siRNA质粒,在肿瘤细胞内诱导RNA干扰,抑制VEGF表达,观察siRNA对放射性核素杀伤肿瘤的增强作用.方法构建针对人VEGF mRNA干扰质粒载体pRNAH-VEGF和对照载体pRNA-Ctr并转染人乳腺癌的MCF-7细胞株.采用RT-PCR和Western blot检测VEGF在mRNA和蛋白水平的表达抑制作用.用放射性核素32P胶体作为放射源照射细胞24 h,采用克隆形成实验分析siRNA对放射性核素杀伤肿瘤的增强作用.结果与对照组相比较,转染了pRNAH(VEGF的MCF-7细胞VEGF mRNA和蛋白质抑制率均明显下调,细胞培养液上清中VEGF浓度下降了60.6%;siRNA和放射性核素联合使用组细胞克隆数量明显少于各自单独使用组;联合使用组细胞凋亡率也高于单独使用组.结论针对人VEGF mRNA干扰质粒载体有效地抑制内源性VEGF表达,增强了放射性核素对肿瘤细胞的杀伤作用.利用RNA干扰技术抑制VEGF表达可作为肿瘤放射治疗中的辅助治疗,以增加疗效.
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YB-1对乳腺癌MCF-7细胞CD44表达和细胞侵袭及成球能力的影响
目的:观察Y-盒结合蛋白1(Y-box binding protein-1,YB-1)对乳腺癌MCF-7细胞CD44表达及细胞迁移、成球能力的影响.方法:应用基因重组技术将YB-1基因及其siRNA构建于腺病毒载体pADeasy-1,重组腺病毒及腺病毒空载体转染乳腺癌细胞株MCF-7;通过蛋白质印迹法,RT-PCR和免疫荧光的方法检测YB-1和CD44的表达;MTT法检测转染后细胞生长速度,并绘制生长曲线;并通过Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移能力;细胞使用无血清培养基培养,并加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后,观察YB-1对细胞成球能力的影响.结果:蛋白质印迹法和RT-PCR结果显示,转染YB-1重组腺病毒载体的MCF-7细胞中,YB-1和CD44 的表达明显高于转染腺病毒空载体组和未转染组;相反,转染YB-1 siRNA重组腺病毒载体的MCF-7细胞中,YB-1和CD44表达明显低于对照腺病毒空载体组和未转染组;免疫荧光也证实CD44蛋白水平与YB-1表达正相关.细胞生长曲线表明,转染YB-1重组腺病毒载体组的细胞生长速度快,而且其侵袭、迁移和成球能力强.结论:YB-1可能通过调控CD44的表达影响人乳腺癌细胞MCF-7的侵袭及成球能力.
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汉黄芩素对MCF-7细胞胰岛素样生长因子-1的影响
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,严重威胁妇女健康.胰岛素样生长因子(insulin like growth factors,IGFs)在乳腺癌的发生发展过程中起着重要的作用,它参与肿瘤细胞凋亡调控,是癌基因及抑癌基因发挥生物活性的关键环节[1].
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葡萄籽多酚对人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR的体内外耐药逆转作用
目的:研究葡萄籽多酚(grape seed polyphenol,GSP)对人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR的体内外耐药逆转作用.方法:采用MTT法检测1.2 mg/L和2.4 mg/L GSP对MCF-7/ADR的体外耐药逆转倍数.建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,实验分为4组:对照组,GSP组,阿霉素(adriamycin,ADR)组和ADR+GSP组,观察GSP对肿瘤细胞的体内耐药逆转作用;采用流式细胞术测定不同用药组P-糖蛋白(Pgp)表达变化.结果:体外1.2 mg/L GSP即可有效逆转耐药,2.4 mg/L GSP的逆转倍数为9.44;体内裸鼠抑瘤实验显示,GSP有一定抑瘤作用,联用ADR可显著抑制肿瘤生长,20 mg/kg GSP可有效逆转CF-7/ADR细胞的耐药性,抑瘤率为54.64%.流式细胞术结果显示,联用GSP与ADR组肿瘤细胞Pgp表达明显低于单独使用ADR组.结论:GSP能在体内外逆转MCF-7/ADR细胞的耐药性,此作用可能是通过抑制Pgp表达实现的.
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地西他滨联合紫杉醇对耐药MCF-7细胞增殖抑制和诱导凋亡的增敏作用
目的：：本研究旨在探讨地西他滨联合紫杉醇对紫杉醇耐药细胞MCF-7的细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的影响。方法：采用CCK-8方法检测联合用药(地西他滨+紫杉醇)或单独用药(地西他滨、紫杉醇)组不同给药浓度在24,48,72 h对耐药细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测不同给药组给药后48 h的细胞凋亡率。结果：CCK-8结果显示联合用药组相较于单药组对细胞增殖抑制作用显著增加(P<0.05),呈剂量依赖性,不同给药组的细胞增殖抑制率随着时间延长而增大；诱导细胞凋亡结果显示,48 h地西他滨单药组和紫杉醇单药组的细胞凋亡率分别是(20.4±1.98)%和(21.8±3.34)%,联合用药组的细胞凋亡率增加至(70.8±8.23)%。结论：地西他滨联合紫杉醇对紫杉醇耐药MCF-7细胞株的增殖抑制作用增加,促进耐药细胞的凋亡,地西他滨联合紫杉醇对耐药细胞株具有协同抗肿瘤作用。
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mitofusin-2对乳腺癌细胞RECK基因表达及MMPs活性的影响
目的 探讨线粒体融合素基因-2(mitofusin-2)对乳腺癌MCF-7细胞株中RECK表达及MMP-9,MMP-2活性的影响.方法 利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFPmfn2转染MCF-7细胞.RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因mRNA的转录水平;Weastem Blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达;明胶酶谱试验检测转染前后MMP-9及MMP-2的活性.结果 转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达Mfn2;RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达;转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高,且MMP-9及MMP-2的活性显著降-低(P＜0.05).结论 mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达,并显著抑制其MMP-9及MMP2的活性.该途径可能是mfn2基因抗肿瘤作用的新机制.
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表皮生长因子受体信号通路在MCF-7细胞对三苯氧胺产生耐药中的作用
背景与目的:以三苯氧胺(tamoxifen,TAM)为代表的内分泌治疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分,研究内分泌治疗耐药的机制、寻找克服耐药的方法有十分重要的意义.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在多种肿瘤中表达.在乳腺癌组织中EGFR的阳性表达提示乳腺癌的预后较差.我们选择雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性的乳腺癌细胞株MCF-7,研究EGFR信号转导通路在TAM产生耐药过程中的作用.方法:ER(+)乳腺癌细胞株MCF-7,持续给予TAM(10-7mol/L)处理形成耐药后,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(fluorescent quantitation reverse transcription-polymerase chain reaction,fqRT-PCR)及Western blot方法,分析EGFR信号通路成分与ER在处理前后的改变,并研究EGFR抑制剂AG1478对耐药细胞的作用.结果:MCF-7细胞给予TAM处理的早期表现为细胞生长的抑制,持续用药(6个月)后,细胞生长速度恢复到用药前水平,细胞生长抑制试验表明MCF-7细胞对TAM耐受.此时耐药MCF-7细胞中EGFR mRNA表达量增加了4.5倍,EGFR蛋白水平明显增加,其下游通路中行的细胞外信号调节激酶磷酸化水平(phosphorylation-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK1/2)也明显提高(P＜0.05),提示EGFR信号转导通路的活性水平增高,而ER蛋白水平无明显变化.同时,耐药MCF-7细胞对EGFR抑制剂AG1478的敏感性增强.结论:ER+的乳腺癌细胞长期给予TAM处理,可通过EGFR信号转导通路的活性水平提高而对内分泌治疗产生耐药,同时给予EGFR抑制剂可提高内分泌治疗的效果.
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Rheb和Rheb'D60K突变基因重组慢病毒载体的构建、鉴定及其对肝癌细胞凋亡的影响
目的 构建携带Rheb和Rheb'D60K突变基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在MCF-7细胞中的表达效果,观察其对肝癌细胞凋亡的影响.方法 PCR法扩增Rheb和Rheb'D60K突变基因,构建重组质粒LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染HEK-293 FT细胞,包装产生慢病毒颗粒.将病毒感染MCF-7细胞后Western blotting检测Rheb及PS6蛋白的表达；将病毒感染SK-HEP-1细胞饥饿处理后观察其凋亡情况.结果 PCR及测序表明成功构建了LV31-Rheb-WT、LV31-Rheb-D60K重组慢病毒载体.Western blotting结果显示慢病毒LV31-Rheb-WT感染的MCF-7细胞内Rheb下游的PS6蛋白表达多于慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的MCF-7细胞.显微镜下慢病毒LV31-Rheb-D60K感染的SK-HEP-1细胞饥饿后凋亡数目多于慢病毒LV31-Rheb-WT感染的SK-HEP-1细胞.结论 本研究成功构建了Rheb和Rheb'D60K突变基因重组慢病毒载体,初步观察到该突变基因重组慢病毒载体可诱导肝癌细胞凋亡,为进一步研究Rheb基因在肝癌发生发展中的作用,进而开展肝癌的临床靶向治疗研究奠定了基础.
