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先导化合物RY10-4体外抑制乳腺癌细胞活性研究
目的 本研究在前期先导化合物RY10-4制备和初步抗肿瘤活性筛选的基础上,进一步利用细胞体外实验,考察其对乳腺癌肿瘤细胞的敏感性和作用强度,为随后进行的体内实验提供参考,为进一步研究其药理活性奠定基础.方法 利用MTT法评价RY10-4对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖抑制活性.结果 RY10-4对乳腺癌细胞株MDA-MB-231呈现明显的浓度依赖关系,随着浓度的增加其抑制作用逐渐增加,当其药物浓度为40 μmol/L时,其抑制率为86.7％.IC50值为0.38.结论 先导化合物RY10-4在体外具有良好的抑制乳腺癌细胞活性.
关键词： 乳腺癌 MDA-MB-231细胞株 MTT法 RY10-4 -
抑制肿瘤细胞骨保护素表达对乳腺癌细胞致骨转移能力的影响
目的 观察抑制肿瘤细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞株致骨转移的影响.方法 32只4～6周龄雌性裸鼠被随机分为A、B、C、D 4组,每组8只,A、C组的每只裸鼠按分组分别以5×105个MDA-MB-231细胞注射入左心室(A组)或左胫骨骨髓腔(C组).B、D组的每只裸鼠按分组分别以5×105个MDA-MB-231i细胞(OPG表达抑制)注射入左心室(B组)或左胫骨骨髓腔(D组),42 d后行病理检查,比较A、B组骨转移发生率和骨转移灶数量,以及C、D组的骨肿瘤体积.定量资料的比较采用t检验或秩和检验,定性资料比较采用Fisher确切概率检验.结果 A组有6只发生骨转移,全组共检出不连续性骨转移灶23处;B组有3只发生骨转移,全组共检出不连续性骨转移灶8处.A组的骨转移发生率和转移灶数量虽高于B组,但两者差异并无统计学意义(P>0.05).C组肿瘤平均体积为(66.29±41.01) mm3, D组肿瘤平均体积为(23.70±16.14) mm3,C组骨肿瘤体积大于D组,两组间差异有统计学意义(P＝0.02).结论 乳腺癌细胞致骨转移能力与其OPG表达水平密切相关,抑制OPG表达可以降低乳腺癌细胞致骨转移的能力.
关键词： 乳腺肿瘤 骨转移 骨保护素 MDA-MB-231细胞株 -
建立乳腺癌骨转移动物模型方法的比较研究
目的 对四种乳腺癌骨转移动物模型的构建方法进行比较研究.方法 32只4-6周龄雌性裸鼠随机分为A、B、C、D 4组,每组8只,每只裸鼠以5×105个MDA-MB-231细胞按分组分别注射入左第二乳房脂肪垫、尾静脉、左心室和左胫骨骨髓腔.观察A组裸鼠乳腺原位成瘤情况、全组注射致死情况和全组49 d后骨转移发生情况.结果 A组乳腺原位移植瘤形成率为87.5%(7/8).仅C组注射致死裸鼠1只.各组骨转移发生率分别为:0(0/8)、12.5%(1/8)、71.4%(5/7)、100%(8/8).A组和C组、A组和D组、B组和C组、B组和D组之间骨转移发生率差异均有统计学意义.结论 肿瘤细胞经乳腺原位移植和尾静脉注射移植两种方法不适用于建立乳腺癌骨转移模型;肿瘤细胞经左心室注射移植和骨原位移植方法能稳定地获得骨转移,是乳腺癌骨转移动物模型构建的可行方法.
关键词： 乳腺肿瘤 骨转移 动物模型 MDA-MB-231细胞株 -
BALB/C小鼠MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌移植模型的建立和评价
目的 建立BALB/C小鼠MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌移植模型,并比较二者的生物学与形态学特征.方法 20只BALB/C小鼠随机分为两组,每组10只.将MCF-7和MDA-MB-231细胞悬液分别接种于两组裸鼠腋下,制作小鼠原位乳腺癌模型.比较两组的成瘤时间、成瘤率、肿瘤生长速度、肿瘤形态、肿瘤的组织学表现、远隔转移情况、ER和PR表达.结果 两组的接种成功率均为100％.MDA-MB-231组于接种后14 d左右成瘤,MCF-7组约10d左右成瘤.两组的生长曲线相似.第8周时MDA-MB-231组肿瘤体积[(3.204±0.157) cm3]大于MCF-7组[(2.912±0.312) cm3],差异有统计学意义(t=2.642,P＜0.05);MDA-MB-231组远隔转移高于MCF-7组.两组的病理结果均为浸润性导管癌.MDA-MB-231组的ER、PR表达均为阴性,MCF-7组的ER和PR表达均为阳性.结论 2种细胞系所建立的的乳腺癌移植型裸鼠模型均较理想,基本保持了人乳腺癌细胞的生物学特性.
关键词： 乳腺癌 动物模型 MDA-MB-231细胞株 MCF-7细胞株 -
酸浆苦味素B对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制作用
目的 观察酸浆苦味素B(physalin B,PB)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制及促凋亡作用.方法 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测PB对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制作用,荧光显微镜观察吖啶橙(A0)染色细胞的变化,流式细胞术检测6,6'-四氯-1,1 ',3,3'-四甲基咪唑并羰花青碘化物(JC-1)染色细胞凋亡;采用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)法检测细胞活性氧(ROS)含有量的变化;免疫印迹法(Western blot)检测PB对MDA-MB-231细胞凋亡相关蛋白表达.结果 PB可显著抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,呈剂量依赖性;随着PB浓度的增加,AO染色细胞形态与对照组相比,呈现凋亡特征;PB作用于MDA-MB-231细胞后,与对照组比较,细胞线粒体膜电位明显下降;细胞内ROS水平上升,具有显著性差异(P＜0.05);PB作用人MDA-MB-231细胞24 h后,能促进促细胞凋亡蛋白Bax的表达,提高激活型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3)的表达,降低抗细胞凋亡蛋白Bcl-2、pro-Caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3前体)蛋白表达水平(P＜0.05).结论 PB能降低细胞线粒体的膜电位,提升细胞ROS水平,促进细胞凋亡,具有良好的抗肿瘤作用.
关键词： 酸浆苦味素B(PB) 细胞凋亡 乳腺癌 MDA-MB-231细胞株 -
抗原负载的DC诱导CIK对MDA-MB-231细胞的杀伤活性研究
探讨乳腺癌相关抗原负载后树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对MDA-MB-231乳腺癌细胞株的杀伤效应.采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞( PBMC),常规法诱导DC、CIK细胞;流式细胞技术分析测定细胞表型;用反复冻融法制备MDA-MB-231细胞的相关抗原,并测定抗原浓度;MTT法分别测定在四个不同效靶比时CIK、DC+CIK和抗原负载的DC+CIK三组效应细胞对MDA-MB-231乳腺癌细胞的杀伤活性.结果:CIK细胞分别与DC和Ag-DC共培养后,可见CD3+ CD56+双阳性表达细胞较培养前显著增加(P＜0.05);将负载肿瘤相关抗原的DC与CIK共培养后,杀瘤活性明显提高(P＜0.05).提示,抗原负载的DC与CIK细胞共同孵育培养后,在相同效靶比时,对MDA-MB-231乳腺癌细胞杀伤效应与CIK细胞和DC-CIK两组效应细胞相比有显著提高,表明抗原负载后可提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,为乳腺癌临床生物免疫治疗提供实验室基础.
关键词： 乳腺癌 MDA-MB-231细胞株 肿瘤抗原 DC CIK -
肿瘤高甲基化基因1重要下游基因HMMR对乳腺癌细胞株MDA-MB-231迁移和侵袭能力影响的体外实验
目的:探讨肿瘤高甲基化基因1(hypermethylated in cancer 1,HIC-1)与透明质酸介导的细胞游走受体(hyaluronan-mediated motility receptor,HMMR)基因之间的调控关系,观察HMMR产物对MDA-MB-231乳腺癌细胞株的迁移和侵袭能力的影响.方法:MDA-MB-231细胞分别转染双链小激活RNA (small activating RNA,saRNA) HIC-1和双链小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA) HMMR,通过反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白印迹法检测观察转染后HIC-1、HMMR的mRNA和蛋白的表达情况,用CCK-8细胞增殖实验检测HIC-1和HMMR表达改变对乳腺癌细胞增殖能力的影响,再用Transwell小室观察其改变对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响.结果:转染saRNA HIC-1时MDA-MB-231细胞中HIC-1上调,同时HMMR表达下调,细胞的迁移和侵袭能力受抑制,细胞增殖能力未发生改变;转染siRNA HMMR时,MDA-MB-231细胞中HMMR表达下调,细胞的迁移和侵袭能力受抑制,细胞增殖能力未受影响.结论:HIC-1可调控HMMR的表达,HIC-1表达上调可下调HMMR,乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力受抑制;乳腺癌细胞中因HIC-1失活,导致HMMR呈高表达,促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭.
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荜茇明碱对人乳腺癌MDA- MB-231细胞放射增敏作用
目的 探讨荜茇明碱对人乳腺癌MDA- MB- 231细胞的放射增敏作用及其可能机制.方法体外培养MDA- MB- 231细胞,取对数生长期细胞进行实验.将细胞分为对照组、X射线照射组、荜茇明碱处理组、荜茇明碱联合X射线照射组.克隆集落形成法分析荜茇明碱对MDA- MB- 231细胞的放射增敏作用,按多靶单击模型拟合细胞存活曲线,确定存活分数(SF)、平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq),计算放射增敏比(SER).用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡;用Western blot观察凋亡相关蛋白的表达;DCFH- DA探针结合FCM分析细胞内活性氧水平的变化.结果克隆形成试验显示,与单纯X射线照射组细胞相比,荜茇明碱联合X射线照射组细胞克隆形成能力下降,SF2、D0及Dq均下降(P均＜ 0.05),其放射增敏比(SERD0)为1.22及1.29.与单纯X射线照射组相比,荜茇明碱联合X射线照射组细胞凋亡明显增加.与对照组和单独处理组相比,荜茇明碱与X射线联合处理组使Bcl- 2表达明显减少,Bax的表达明显增加.荜茇明碱提高了X射线照射引起的细胞内活性氧的水平.结论低浓度的荜茇明碱增加了MDA- MB- 231细胞的放射敏感性,可能与其调控凋亡相关蛋白表达并且升高细胞内活性氧水平,从而增加X射线诱导的细胞凋亡有关.
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两种MDA-MB-231乳腺癌细胞原位移植型裸鼠模型制作比较
目的 比较组织块法和细胞悬液法制作MDA-MB-231细胞乳腺癌原位移植型裸鼠模型的生物学特性与形态学特征.方法 20只BALB/c小鼠随机分为两组,每组10只.将组织瘤块和细胞悬液分别接种于两组裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内,制作小鼠原位乳腺癌模型.比较两组的成瘤时间、成瘤率、肿瘤生长速度、肿瘤形态、肿瘤中心坏死、肿瘤表面血管分布情况和肿瘤表面溃疡出现时间,并观察肿瘤的组织学表现.结果 两组的成瘤率无显著性差异.组织块法的成瘤时间早,瘤块形态欠规则,肿瘤血管少,易形成肿瘤中心坏死和表面溃疡;细胞悬液法的成瘤时间晚,瘤块形态规则,肿瘤血管丰富,中心坏死少,表面溃疡出现晚.病理学检查两组无显著差异.结论 组织块法和细胞悬液法均可成功制作小鼠原位乳腺癌模型,其生物学特性较一致,形态学各有特点,可根据实验要求选择不同的制作方法建立动物模型.
关键词： 乳腺癌 动物模型 MDA-MB-231细胞株 裸小鼠 -
基于NF-κB通路评价益气小复方对三阴性乳腺癌顺铂耐药的逆转作用
目的:探讨益气小复方(Yiqi Formula)逆转三阴性乳腺癌顺铂(platinum,DDP)耐药细胞株MDA-MB-23 1/DDP耐药的能力及其潜在的机制.方法:采用MMT检测协同效应浓度下的益气小复方对DDP诱导三阴性乳腺癌DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP生长抑制的影响,随后采用流式细胞仪检测益气小复方联合DDP对MDA-MB-231/DDP诱导凋亡的增敏作用;应用电感耦合质谱仪检测比较益气小复方联合DDP组与单用DDP组MDA-MB-231/DDP胞内铂离子浓度累积的差异,并采用Western Blot检测益气小复方对耐药相关蛋白以及对NF-κB通路的调控作用.同时,建立乳腺癌移植瘤模型,分为对照组、DDP组、益气小复方组和益气小复方联合DDP组以做进一步验证.结果:益气小复方联合DDP可使MDA-MB-231/DDP耐药指数显著降低(P＜0.01),且MDA-MB-231/DDP在不同浓度DDP作用下联合作用组均比单用DDP组凋亡比例显著增加(P＜0.05或P＜0.01);益气小复方联合DDP可显著增加MDA-MB-231/DDP细胞株胞内铂浓度(P＜0.01);联合组中P糖蛋白(P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和多药耐药相关蛋白2(MRP2)的表达量分别是DDP组的41％、36％、47％(均P＜0.001);益气小复方联合DDP组中IKKα蛋白表达和NF-κB蛋白核内积累水平均较其他组显著降低(均P＜0.01).体内实验结果提示,益气小复方联合DDP组较其他组瘤体体积增加较慢(P＜0.05)、剥瘤前通过荧光活体成像荧光值低(P＜0.05)以及终瘤体的质量小(P＜0.05).结论:益气小复方可能通过抑制了NF-κB通路的活性,进而下调相关转运蛋白超家族成员P-gp、BCRP和MRP2的表达从而逆转MDA-MB-231/DDP细胞对DDP的耐药作用.
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稳定表达GRIK3乳腺癌MDA-MB-231细胞株的筛选及鉴定
目的 构建稳定表达GRIK3的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,为研究GRIK3在乳腺癌中的生物学功能奠定基础.方法 以非病毒质粒3×Flag-GRIK3为模板,PCR扩增目的基因,将目的基因与慢病毒载体表达质粒重组连接,重组质粒、包装质粒psPAX2以及包膜质粒pMD2.G共转染293T包装细胞,将获得的重组慢病毒感染乳腺癌MDA-MB-231细胞株,连续使用嘌呤霉素7天筛选稳定转染的细胞株.在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况以鉴定稳定表达目的基因细胞株,采用QPCR和Western blotting分别检测稳定表达细胞株及空载体对照细胞中GRIK3的表达.结果 PCR成功扩增出目的基因,扩增后产物与慢病毒载体成功连接,连接后的重组慢病毒载体经DNA测序鉴定插入基因序列正确.重组慢病毒质粒、包装质粒psPAX2以及包膜质粒Pmd2.G成功转染293T细胞,收集的慢病毒能够成功转染MDA-MB-231细胞,并且在显微镜下能够观察到稳定表达GRIK3 MDA-MB-231细胞中明亮的绿色荧光.QPCR结果显示,GRIK3 mRNA在重组MDA-MB-231细胞中的表达水平为5.443±0.459,显著高于对照组的1.0±0.152,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blotting结果显示,GRIK3蛋白在重组MDA-MB-231细胞中的表达水平为2.502±0.092,高于对照组的0.653±0.032,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 成功构建了重组GRIK3慢病毒载体,并筛选出稳定表达GRIK3蛋白的MDA-MB-231细胞株,为进一步探索GRIK3在乳腺癌发生、发展中的机制奠定了基础.
关键词： 乳腺癌 GRIK3 MDA-MB-231细胞株 稳定表达 -
乳腺癌骨转移动物模型的构建
目的:建立乳腺癌骨转移动物模型. 方法:40只4周～6周龄雌性裸鼠随机分为5组,每组8只,用浓度分别为1×105/ml、1×106/ml、5×106/ml、1×107/ml、5×107/ml的MDA-MB-231细胞悬液0.1ml行左心室注射.观察裸鼠左心室注射致死情况及存活裸鼠49d后骨转移发生情况. 结果:左心室穿刺注射总致死率为32.50%(13/40);各组左心室穿刺注射致死率分别为1/8、1/8、1/8、3/8、7/8,组间比较差异有统计学意义(P＝0.004).全组骨转移发生率为48.15%(13/27);各组骨转移发生率分别为0/7、3/7、5/7、4/5、1/1,各组骨转移发生情况差异有统计学意义(P＝0.014). 结论:经裸鼠左心室穿刺注射肿瘤细胞成功建立了乳腺癌骨转移动物模型,肿瘤细胞浓度为5×106/ml时是经裸鼠左心室注射建立乳腺癌骨转移动物模型的适宜浓度.
关键词： 乳腺癌 骨转移 动物模型 左心室注射 MDA-MB-231细胞株 -
半枝莲对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖、凋亡和迁移的影响
目的 研究半枝莲对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖、凋亡和迁移的影响.方法 MDA-MB-231细胞株培养,分别用生理盐水、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL半枝莲处理细胞,分别于12h、24h和48 h应用酶联免疫检测仪测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期,采用Boyden小室法测定细胞迁移能力.结果 半枝莲呈浓度和时间依赖抑制MDA-MB-231细胞生长;呈剂量依赖促进细胞凋亡100 μg/mL时凋亡细胞比率大为50.0％;呈剂量依赖性阻滞MDA-MB-231细胞周期,G1期细胞比率,降低S期和G2期细胞数;呈剂量依赖性抑制MDA-MB-231细胞的迁移,100 mg/mL时显著抑制MDA-MB-231细胞迁移.结论 半枝莲浓度为100μg/mL时,可有效阻滞细胞周期,抑制MDA-MB-231细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移.
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MUC1的表达与乳腺癌细胞粘附的关系
背景与目的:近年研究认为,肿瘤的转移与肿瘤细胞膜上粘液型糖蛋白的大量形成有关.本实验研究糖基化抑制剂苯甲基 -α-N-乙酰半乳糖胺对粘蛋白-1( mucin1,MUC1)形成的抑制作用及其对乳腺癌细胞株 MDA-MB-231细胞的粘附、侵袭转移能力的影响.方法:免疫细胞化学法检测 MUC1表达 ,噻唑蓝比色法( MTT)检测细胞对人工基底膜 (Matrigel)的粘附能力 ,明胶酶谱法 (zymography)检测MDA-MB-231细胞 MMP-2、 MMP-9的分泌变化. 结果:经苯甲基 -α-N-乙酰半乳糖胺去糖基化处理后的肿瘤细胞组与相应对照组比较 , MUC1表达降低 ,对基底膜的粘附力明显降低( P< 0.01) ,同时细胞中 MMP-2和 MMP-9的分泌量显著下降.结论: MUC1表达水平与肿瘤细胞的粘附能力相关, MUC1的抑制使乳腺癌 MDA-MB-231细胞粘附能力,分泌Ⅳ型胶原酶能力明显减弱.
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Livin靶向RNA干扰对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究凋亡抑制蛋白Livin靶向RNA干扰MDA-MB-231对细胞增殖和凋亡的影响,探讨其可能的机制.方法 构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体,分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231后,通过RT-PCR、Western blot技术检测干扰前后MDA-MB-231细胞Livin、Caspase-3和Smac/DIABLO在mRNA、蛋白水平的表达;采用MTT法检测对细胞增殖的抑制作用,流式细胞法测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡以及观察细胞形态变化.结果 成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体.它们不同程度地抑制了MDA-MB-231细胞Livin基因的表达,以si-Livin2抑制效率高,它对Livin的mRNA和蛋白的抑制率分别达76.4%,70.2%.si-Livin2转染48 h后,与未转染组相比,细胞增殖活力受到抑制,转染48 h抑制率达36.1%.细胞周期重新分布,G0/G1期上升为(71.75±1.31)%,S期下降为(18.06±1.46)%;细胞凋亡率上升为(13.28±1.65)%;电镜下可见典型的凋亡细胞特征.细胞内Caspase-3,Smac/DIABLO的mRNA、蛋白表达有所上升.结论 Livin靶向RNA干扰通过上调Caspase-3,Smac/DIABLO表达有效地抑制MDA-MB-231细胞增殖,促进凋亡.
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siRNA表达载体对肝素酶基因的沉默作用
目的 根据基因库中的人肝素酶(HPSE)基因序列,构建针对肝素酶基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染MDA-MB-231细胞后观察其对肝素酶基因的干扰作用. 方法设计肝素酶靶向的发夹状siRNA,合成2条互补的寡核苷酸链共4对,退火后连接入pGPU6/GFP/Neo载体,转化后进行序列鉴定,转染MDA-MB-231细胞,荧光照片,RT-PCR (real-time PCR)检测肝素酶mRNA的表达情况. 结果设计出4条针对肝素酶的siRNA,将退火后的双链寡核苷酸片段克隆到pGPU6/GFP/Neo载体,经过阳性菌落酶切鉴定与测序,结果正确.再将siRNA载体转染到MDA-MB-231细胞株,RT-PCR检测肝素酶mRNA表达明显降低(P<0.05).结论 成功构建了针对肝素酶基因的siRNA载体,转染到MDA-MB-231细胞株后细胞肝素酶基因的表达明显降低,从而为肿瘤治疗提供了一种新的方法.
