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细菌脂蛋白对人单核细胞内细胞髓系分化因子88及肿瘤坏死因子表达的影响
目的 观察在不同剂量细菌脂蛋白(BLP)刺激后,人单核细胞(THP-1)髓系分化因子88蛋白(MyD88)的表达及肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的变化. 方法 用小剂量BLP诱导THP-1产生耐受,再以大剂量BLP攻击,分别比较对照组、BLP耐受组、耐受后攻击组和直接攻击组MyD88和TNF-α的表达.用Western Blot测定MyD88蛋白含量,ELISA法测定TNF-α含量. 结果 BLP耐受组、耐受后攻击组和直接攻击组的TNF-α水平均高于对照组,而耐受后攻击组的TNF-α表达明显低于直接攻击组,各组间MyD88蛋白含量无明显改变. 结论 BLP可刺激机体产生炎症因子,小剂量BLP诱导THP-1细胞产生BLP耐受,抑制细胞表达TNF-α,但不同剂量BLP对MyD88的蛋白表达无影响.
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IL-10对细菌脂蛋白诱导乳大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用
目的 探讨白细胞介素-10(IL-10)对细菌脂蛋白(BLP)诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用.方法 (1)体外培养大鼠乳鼠心肌细胞,以1μg/ml的BLP分别刺激心肌细胞0、12、24、36、48h.(2)以不同浓度的BLP(1 μg/ml和5μg/ml)和TNF-α(20 ng/ml和60 ng/ml)分别刺激心肌细胞24h.(3)将细胞分为五组,正常对照组、BLP(1μg/ml)组、IL-10(20 ng/ml)组、IL-10(20 ng/ml)+ BLP(1μg/ml)组及BLP(1μg/ml)+IL-10(20ng/ml)组,刺激细胞24h.提取细胞蛋白,Western blot法检测心肌细胞procaspase-3、cleaved caspase-3、bcl-2及bax蛋白的表达水平.结果 (1)BLP刺激心肌细胞24h后,caspase-3被明显激活,表现为cleaved caspase-3的表达逐渐增加.(2)与正常对照组比较,不同浓度的BLP和TNF-α分别刺激心肌细胞24h后可明显促进cleaved caspase-3表达增加(P＜0.01),且5μg/ml的BLP较1μg/ml的BLP刺激细胞后cleaved caspase-3的表达更高(P＜0.05).(3)与正常对照组相比,BLP组中心肌细胞cleaved caspase-3的表达明显升高(P＜0.01),而bcl-2/bax的比率显著降低(P＜0.01).与BLP组相比,IL-10+ BLP组和BLP+ IL-10组中,心肌细胞cleaved caspase-3水平显著降低(P＜0.01),而bcl-2/bax比率明显升高(P＜0.05),但这两组间无统计学差异.结论 IL-10对细菌脂蛋白诱导的乳大鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用.
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细菌脂蛋白耐受中核转录因子核转位机制研究
目的 探讨细菌脂蛋白(BLP)耐受所致核转录因子-κB(NF-κB)活化受抑制的分子机制.方法 以不同浓度BLP(10、100、1 000 ng/ml)预处理人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导BLP耐受,再以不同浓度BLP(0、10、100、1 000 ng/m1)刺激经BLP预处理(耐受组)或未经BLP预处理(对照组)的THP-1细胞,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放,确定适的BLP预处理和刺激浓度.然后按此条件处理细胞不同时间(0、0.5、1、2、6 h)并提取蛋白,用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测NF-κB亚单位p50和p65的表达、核转位及磷酸化情况.结果 对照组中10、100、1 000 ng/mlBLP可剂量依赖性刺激THP-1活化并产生TNF-α(pg/ml:184.86±32.51、3 215.88±167.09、6 042.96±245.37),耐受组中100 ng/ml BLP预处理几乎完全抑制不同剂量BLP诱导的TNF-α释放.故适BLP预处理浓度为100 ng/ml,刺激浓度为1 000 ng/ml.Western blotting检测表明,在BLP耐受的细胞质中p50蛋白表达明显高于对照组(0 h:542.9±15.6比272.8±13.2,0.5 h:558.0±16.9比236.4±11.8,1 h:524.7±17.5比211.6±9.8,2 h:584.9±15.6比222.4±12.3,均P＜0.01),而两组间p65蛋白无明显差异.BLP刺激还可诱导对照组细胞中p50和p65发生核转位,即细胞核中p50和p65蛋白增加(1 h p50:344.2±13.6比79.0±5.2,p65:78.4±4.5比0,均P＜0.05),而耐受组细胞核中p50和p65均无明显变化.另外,BLP刺激还可诱导对照组细胞中p65的536位丝氨酸发生快速磷酸化(0.5 h:0.67±0.08比0.04±0.01,1 h:0.71±0.11比0.04±0.01,均P＜0.05).但是在BLP刺激的耐受组细胞中磷酸化p65蛋白水平无明显变化.结论 BLP耐受的THP-1细胞中抑制性NF-κB亚单位p50表达上调,而具有转活化能力的亚单位p65的核转位及磷酸化均受到抑制,可能是BLP耐受中TNF-α等NF-κB依赖的基因表达减少的分子机制之一.
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IL-10对细菌脂蛋白诱导乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用
目的 探讨白介素-10(IL-10)对细菌脂蛋白(BLP)诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用.方法 体外培养乳鼠心肌细胞,以1μg/ml的BLP分别刺激心肌细胞12、24、36、48 h.将细胞分为正常对照组、BLP(1μg/ml)组、IL-10(20 ng/ml)组、IL-10(20 ng/ml)+ BLP(1μg/ml)组及BLP(1 μg/ml)+IL-10(20 ng/ml)组,刺激细胞24 h.Western印迹检测心肌细胞bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表达水平.结果 BLP刺激心肌细胞24h后,caspase-3被明显激活,有活性的caspase-3片段表达逐渐增加；与正常对照组相比,BLP组中心肌细胞有活性的caspase-3片段表达明显升高(P＜0.01),而bcl-2/bax的比率显著降低(P＜0.01).与BLP组相比,IL-10+ BLP组和BLP+ IL-10组中,心肌细胞有活性的caspase-3片段水平显著降低(P＜0.01),而Bcl-2/Bax比率明显升高(P＜0.01).结论 IL-10对BLP诱导的乳鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用.
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TLR1/2信号促CD8+T细胞功能及其机制
目的:探讨Toll受体1/2(Toll like receptor 1/2,TLR1/2)信号对荷瘤小鼠来源的CD8+T细胞功能的影响及其可能机制.方法:利用小鼠Lewis肺癌细胞株3LL建立小鼠肺癌荷瘤模型,MACS分选小鼠脾CD8+T细胞;体外经PBS或TLR1/2激动剂BLP刺激后,Real-time PCR和流式细胞术分别从基因和蛋白水平检测CD8+T细胞的TLR分子表达;用ELISA和流式细胞术检测经PBS或BLP刺激后的CD8+T细胞分泌细胞因子和增殖的能力,并用关键信号分子抑制剂分析可能的分子机制.结果:与PBS对照组相比,TLR1/2激动剂BLP不但有效上调荷瘤机体CD8 +T细胞TLR1和TLR2分子的基因水平[TLRI:(0.353 ±0.015) vs(0.101 ±0.017),P＜0.01;TLR2:(0.232 ±0.031) vs (0.080 ±0.004),P＜0.05]及蛋白水平(P＜0.05),而且显著促进CD8+T细胞分泌功能性细胞因子[IFN-γ:(2 375±305) vs(850±50),P＜0.05;IL-2:(1 600±200) vs(350 ±50),P＜0.05]和增殖的能力(P＜0.05),这一效应依赖于NF-κB和P38通路.结论:TLR1/2信号直接作用于荷瘤小鼠的CD8+T细胞并促进其功能,该研究既丰富了TLR的作用范围,也为基于TLR激动剂的肿瘤生物治疗提供了实验依据.
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胸腺肽α1对THP-1细胞Toll样受体2和MyD88以及TNF-α表达的影响
目的:观察人THP-1细胞与胸腺肽α1(Tα1)孵育后,予细菌脂蛋白(BLP)刺激后,Toll样受体2(TLR2)、髓系分化因子88(MyD88)蛋白的表达及细胞因子TNF-α的变化.方法:实验采用人THP-1细胞系进行细胞培养,分为4组:对照组为THP-1细胞不加任何刺激;BLP组以1 000 ng/ml BLP刺激2 h;Tα1组为THP-1细胞加1 000 ng/ml Tα1孵育24 h,不加BLP刺激;Tα1+BLP组为THP-1细胞加1 000 ng/ml Tα1孵育24 h后再加1 000 ng/ml BLP刺激2 h.以Western blot分析TLR2、MyD88蛋白含量.ELISA法测定TNF-α.结果:与对照组相比,BLP组和Tα1+BLP组的TNF-α均显著增加,而Tα1组无显著改变;在TLR2和MyD88的表达上,Tα1组和Tα1+BLP组均高于对照组和BLP组.结论:胸腺肽α1可增加THP-1细胞TLR2、MyD88蛋白的表达,其对免疫细胞的影响与BLP诱发炎症反应的途径不完全一致.
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芍药苷对细菌脂蛋白诱导的THP-1细胞炎症因子表达的影响
目的 研究芍药苷对细菌脂蛋白(BLP)诱导的人单核细胞系(THP-1)细胞炎症因子表达的影响.方法 采用THP-1进行细胞培养,加入同一浓度BLP(1000 ng/ml)分别培养1、2、4、6、8、12、24,36、48 h,及将BLP刺激后的THP-1细胞与不同浓度芍药苷(10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)分别作用4 h和48 h后,收集细胞上清液;用ELISA法分别测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平.结果 给予BLP刺激后,TNF-α及IL-6均有明显增加,TYF-α在4 h达高峰,IL-6在24 h后显著升高,48 h达高峰.芍药苷体外作用可呈浓度依赖性抑制BLP刺激后THP-1细胞表达TNF-α、IL-6的水平(P<0.01).结论 芍药苷可通过抑制TNF-α、IL-6的释放,减轻炎症反应.
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细菌脂多糖、脂蛋白和DNA体内协同致病作用观察
目的观察细菌脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)、脂蛋白(bacterial lipoprotein, BLP)及其DNA[鸟嘌呤二核苷酸(CpG)寡核苷酸(oligonucleoetide), CpG-ODN]的体内协同致病作用. 方法 147只小鼠随机分为等渗盐水对照组、单纯LPS组、单纯CpG-ODN组、单纯BLP组、LPS+BLP组、LPS+ CpG-ODN组和LPS+BLP+CpG-ODN组,尾静脉注射给药,观察小鼠死亡率及血清肿瘤坏死因子(TNF)-α水平. 结果注射后12,24,48 h,二联组的死亡率显著高于单独给药组(P <0.05或P< 0.01);三联给药组各时相点死亡率显著高于二联组(P<0.05).单独给药后6 h,TNF-α水平均显著高于对照组(P<0.05),12,24 h与对照组比较,差异无统计学意义.二联组与单因素组和对照组比较,6,12 h血TNF-α均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05).三者联合刺激时,6,12 h血TNF-α与二联组比较,差异有统计学意义(P<0.05),至24 h仍显著高于对照组(P<0.05). 结论细菌LPS、细菌脂蛋白和细菌DNA不仅自身存在一定的致病能力,而且三者间具有明显的协同效应,特别是三者联合给药时作用强.
