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镍对胚胎神经干细胞增殖和分化的调节
目的:观察T型钙通道阻断剂镍对胚胎神经干细胞的调节,分析T型钙通道在神经干细胞增殖和分化中的作用.方法:实验于2004-08/2006-01在南方医科大学神经生物学教研室完成.选取清洁级成年雌性Wistar孕鼠1只,分离大脑半球,制成单细胞悬液,利用无血清培养技术,在添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27 supplement的DMEM/F12培养基中培养胚胎神经干细胞,当神经球增大至50～200个细胞/球时,即可传代.取第3代胚胎神经干细胞,在培养基中分别加入0,0.25,0.5,1.0mmol/L的氯化镍,以BrdU免疫荧光、四唑盐、流式细胞仪检测细胞增殖指数以及DCX和S-100β阳性细胞数.结果:①神经干细胞体外培养的鉴定:取原代和传代培养的细胞进行免疫荧光鉴定,发现均有细胞表达nestin抗原.传至第3代时,其阳性比例可达99%.②诱导分化及鉴定:分化2 d后,镜下观察细胞长出突起,已初步具有神经元和胶质细胞形态.免疫荧光染色显示分化细胞呈现DCX和S-100β阳性.③细胞增殖检测结果:加入0.25,0.5,1.0 mmol/L的氯化镍处理细胞,MTT检测其吸光度值分别为未加入氯化镍的62.09%,48.20%,34.85%,呈浓度依赖性降低(P均＜0.001);免疫荧光检测BrdU阳性细胞数分别为未加入氯化镍的85.75%,74.25%,57.01%(P＜0.05).流式细胞仪检测加入0.5 mmol/L氯化镍的单细胞悬液其增殖指数显著高于未加入氯化镍的单细胞悬液(66.11%,1.016%,P＜0.001).④镍对细胞分化的影响:单细胞悬液加入0.25,0.5,1.0 mmol/L氯化镍后,BrdU阳性细胞数量减少(P均＜0.001);DCX阳性细胞数分别比未加入氯化镍的单细胞悬液增加23%,52%,58%(P＜0.05或0.01);S-100β阳性细胞数增加85%,105%,110%(P＜0.05或0.01).结论:T型钙通道阻断剂镍可抑制胚胎神经干细胞的分裂增殖,促进其分化,提示T型钙通道可能参与胚胎神经干细胞增殖分化的调节.
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神经干细胞对缺血性脑损伤的反应能力
背景;当中枢神经系统受损伤时,Nestin蛋白的重新表达可能增加细胞抗损伤的能力,有利于损伤灶的修复.目的:通过永久性脑缺血神经干细胞迁移及Nestin蛋白表达的变化,探讨永久性脑缺血情况下神经干细胞的反应性.设计:以实验动物为研究对象,随机对照的验证性研究.单位:一所专科学校的解剖学教研室和一所大学的解剖学教研室.材料:实验于1999-10/2001-01在西安交通大学医学院人体解剖学教研室进行,选择健康SD大鼠75只.随机分为正常对照组、实验组和假手术组,每组25只.各组动物均在术后1,3,7,14和28 d,断头取脑,每个时间点5只大鼠.方法:以永久性大鼠脑缺血为模型,采用免疫组化染色方法,观察脑缺血1,3,7,14和28 d时,神经干细胞的迁移及其神经干细胞标记物Nestin蛋白的变化.主要观察指标:①免疫组化染色结果.②Sza区Nestin阳性细胞在正常和缺血后不同时间点脑组织中的迁移距离.③缺血后不同时间点缺血区附近Nestin阳性细胞数的变化.结果:通过Nestin免疫组化染色,发现正常脑组织中神经干细胞主要位于室管膜下区.室管膜下区的神经干细胞在缺血后沿胼胝体腹侧向缺血区方向发生了迁移.其中,缺血7 d时达到远.缺血灶附近在缺血1 d时就出现较多的Nestin阳性细胞,缺血3 d以后逐渐减少.结论:神经干细胞对缺血性脑损伤有一定的反应能力,Nestin蛋白表达于缺血附近可能是一种对损伤的保护机制.
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兔脊髓损伤不同时期的神经干细胞移植治疗的效果
目的:研究新西兰大白兔脊髓损伤后不同时期神经干细胞(neural stem cells,NSCS)移植治疗的不同效果,探讨脊髓损伤移植治疗的佳时机.方法:体外培养、诱导新西兰大白兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)为NSC并行5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxy uridine/5-bromo-2-deoxy uridine,BrdU)标记.手术造成兔脊髓全横断模型,在术后即时,7,14,21,28 d分别行NSC局部移植,同时设立脊髓全横断空白对照组,正常对照组.于移植后3个月观察动物脊髓损伤局部病理变化.结果:术后即时移植组局部仅有少量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目少;7,14 d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目多,神经纤维排列较整齐;21,28 d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,但通过脊髓损伤区的神经纤维数目少,且再生的神经纤维排列紊乱;空白对照组未发现Brdu标记阳性细胞,在脊髓损伤区域未发现再生通过的神经纤维.结论:实验证明了脊髓损伤后7～14 d为NSC佳移植时期,同时提示NSC移植对动物脊髓损伤后的组织修复具有促进作用.
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类缺血损伤的皮质神经元对外源性神经干细胞分化的影响及其可能机制
目的:研究类缺血损伤的皮质神经元对外源性神经干细胞分化的影响作用,并初步探讨其中可能的机制.方法:2002-09/2003-03在解放军第四军医大学西京医院神经内科实验室和解放军第四军医大学全军神经生物研究所进行.类缺血处理后的小鼠皮质神经细胞与同种异体神经干细胞共培养,通过特异性细胞染色、计数的方法观察神经干细胞分化情况.结果:与缺血处理后的皮质神经细胞共培养的神经干细胞在共培养6～8 d后,其分化趋势以及其向神经元分化的趋向均有增强(P＜0.05).结论:类缺血处理后的皮质神经元对外源性神经干细胞的分化有促进作用,并能促进其向神经元分化.
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生长相关蛋白在脊髓源性神经干细胞向神经主细胞分化过程中的表达
目的:探讨脊髓源性神经干细胞向神经元诱导分化过程中生长相关蛋白43的表达,分析其对脊髓损伤修复的主导作用.方法:实验于2003-03/09在中国医科大学实验动物中心完成.取15只孕14 d的胎鼠,自胎鼠的脊髓区提取神经干细胞,经培养及神经巢蛋白免疫细胞化学鉴定,观察在神经干细胞定向诱导分化为神经元过程中,生长相关蛋白43于不同时间点的形态学表达.培养液为添加B27(2%)、碱性成纤维细胞生长因子(20 mg/L)、表皮细胞生长因子(20mg/L)的无血清培养基DMEM/F12.置于37℃、体积分数为0 05的COz培养箱中悬浮培养,观察其生长情况,每3天换液1次,共培养5次.分别于分化1,2,4,8 d取出载玻片,对生长相关蛋白的表达进行免疫组化检测.总细胞和阳性细胞在显微镜下计数.结果:15只胎鼠的脊髓源性神经干细胞全部进入结果分析.①神经干细胞的培养情况:培养24 h后,可见神经球;第2天时,神经球数目增多,呈桑椹状,折光性强,死细胞无光泽,仅有轮廓.②神经干细胞的鉴定结果:免疫细胞化学染色可见神经球内圆形细胞呈神经巢蛋白抗原强阳性,核未着色.神经干细胞定向分化后,细胞逐渐贴壁,到第4,8天时,细胞逐渐变大,突起变长,偶见多个突起.神经元特异性烯醇化酶阳性的神经元,胞浆及核膜出现棕色阳性反应,细胞核大而圆,无着色.细胞连续计数共712个,其中神经元特异性烯醇化酶阳性细胞296个,比例为41.57%.③神经干细胞分化过程中生长相关蛋白表达的测定:神经干细胞分化第1天,胞质内出现生长相关蛋白,第4天表达增强,于核周及突起中明显,逐渐向胞膜转移,并且长的突起与其他细胞的突起之间形成连接,至分化第8天时这种突起生长停止,神经干细胞分化为成熟的神经元细胞,生长相关蛋白反应减弱并消失.细胞连续计数共736个,其中生长相关蛋白阳性细胞246个,比例为33.42%.结论:在神经干细胞分化为神经元的过程中,生长相关蛋白基因呈一过性表达,参与引导突起的生长并发挥促进作用.
关键词： 干细胞 细胞分化 神经组织蛋白质类/分析 神经系统/细胞学 -
成体神经干细胞及其在神经修复中的应用
神经干细胞是一类具有多分化潜能的未分化细胞.在适宜的环境下可分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞.神经干细胞的无限增殖性和多分化性使其成为细胞移植的良好供体.近年来,成年脑组织内也发现了具有多分化潜能的神经干细胞,成体神经干细胞的发现改变了以往中枢神经系统不可再生的理论,随着对成体神经干细胞研究的深入,通过诱导自体神经干细胞的体内增殖修复损伤的神经元,通过分离自体神经干细胞体外扩增后移植治疗等实验的探索为神经源性疾病的替代性治疗提供了新的思路.
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大鼠脑室膜管下区神经干细胞的贴壁培养及其分化特征
目的:探索大鼠脑室管膜下区神经干细胞的贴壁培养方法及其体外分化特性.方法:实验于2004-10/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室进行.取出生24 h内的SD大鼠,分离其室管膜下区神经干细胞,应用无血清Neurobasal培养基(含20 g/L B27,20μg/L碱性成纤维生长因子、20μg/L表皮生长因子)进行贴壁培养.采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞,以5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法检测细胞增殖能力.体积分数为0.05胎牛血清诱导神经干细胞分化后,用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标志物微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶相应抗体检测神经干细胞分化情况.结果:①在细胞培养第4,5天即可见培养基中出现大量的由几十个细胞构成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞球,即神经球.②神经球贴壁培养24～48 h后形成片状细胞克隆,细胞呈梭形或多角形.③细胞一般七八天传代一次,经七八次传代,培养2个月左右,细胞进入生长停滞状态.④贴壁培养的细胞巢蛋白染色及5-溴脱氧尿嘧啶核苷染色均为阳性.在培养基中加入血清后,免疫细胞化学检测分化后细胞包括微管相关蛋白阳性、胶质纤维酸性蛋白阳性和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶阳性细胞,巢蛋白表达均为阴性.结论:贴壁培养的神经干细胞在体外经多次传代培养后仍可保持较强的增殖能力,仍保持了其本身的特性,同时具有多分化潜能的特性,因此可以认为贴壁培养法可作为一种理想的神经干细胞的培养方法.
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兔骨髓基质细胞体外培养、诱导及分化成神经干细胞的实验研究
目的:研究新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况. 方法:梯度密度离心法分离新西兰大白兔骨髓基质细胞( BMSCs),于体外用神经干细胞培养基和多种细胞因子进行培养、诱导、分化,细胞免疫化学方法进行鉴定. 结果:新西兰大白兔骨髓基质细胞能在体外培养中增殖、分化,具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白 (Nestin),这些细胞终能分化出类神经元样细胞,免疫细胞化学检测可见有神经核蛋白抗体( NeuN)的表达. 结论:新西兰大白兔骨髓基质细胞是具多向分化潜能的细胞,具有较强的增殖、自我更新能力.在适宜的条件下,可以分化成能表达神经系细胞特异性抗原的细胞.骨髓基质细胞来源方便、取材较容易,体外培养和扩增的技术条件简便,具有向神经系细胞分化的潜能,可以考虑作为细胞移植治疗的种子细胞.
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HD02对新生大鼠海马神经干细胞增殖分化和细胞周期的影响
目的:观察 HD02对新生大鼠体外培养神经干细胞( neural stem cell,NSC)增殖、分化和凋亡的影响. 方法:分离、培养新生大鼠海马 NSC,采用免疫荧光双标技术检测 NSC增殖分化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化. 结果: HD02的中低剂量组 BrdU阳性细胞数、 BrdU+ Nestin,BrdU+ NeuroD,BrdU+ NF200,BrdU+ GFAP,BrdU+ Oli阳性细胞数和 S期细胞比率明显高于空白对照组和 EGB761组 (P< 0.01), G0/G1期比率 (51.12± 3.66)%明显低于正常对照组 (68.23± 3.30)%;细胞凋亡率 (5.18± 0.80)%与 EGB761(4.98± 0.40)%相比差异无显著性意义 (P >0.05),但却明显低于正常对照组 (6.43± 0.55)% (P< 0.01). 结论:HD02能显著促进 NSC增殖分化.其机制可能与缩短 G0/G1期、减少凋亡、促进 S期比率有关.
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神经干细胞和脑肿瘤干细胞与胶质瘤发生发展潜在性研究
自从1992年Reynolds从成年小鼠纹状体中分离到能够不断增殖、具有多向分化潜能的细胞群、提出了神经干细胞(neural stem cell,NSC)的概念以来,NSC的研究已成为神经科研的一个重要领域.
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Wif1在神经系统发育中的研究进展
WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)早作为人视网膜表达序列标签被人们所认识,后被证明是一种Wnt分子的胞外抑制剂,属于sFRP家族.WIF-1可以直接与Wnt分子结合,抑制Wnt分子与受体细胞膜上的Frizzled受体及辅助受体LRP5/6形成三聚体复合物,从而抑制了信号传导. Wif1 在斑马鱼、爪蟾、小鼠和人的神经系统均有表达,参与爪蟾神经系统A-P轴的分化,影响小鼠视杆细胞的形成. Wif1 在胚胎期小鼠中枢神经系统中表达强烈,提示在胚胎期神经系统发育中, Wif1 可能对Wnt信号通路活性起着时空特异性的调节作用.Wnt信号通路在脊椎动物中枢神经系统发育中发挥着重要的作用,但人们对 Wif1 在神经系统发育中的功能却知之甚少.根据 Wif1 在神经发育中的表达谱信息,可以选取合适的研究时期和部位,研究 Wif1 在神经发育中的功能.
关键词： 信号传导 神经系统/细胞学 胞间信号肽类和蛋白质类 Wif1 -
PPARγ在神经干细胞的表达
[目的]探讨神经干细胞(NSCs)增殖和分化过程中过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达情况及意义.[方法]体外分离培养神经干细胞,诱导其分化,先用免疫荧光法查看PPARγ在NSCs中的定位,然后分别取未分化的及诱导分化后d1、d5、d9的NSCs,应用RT-PCR和Western Blot法检测各相应时间点NSCs内PPARγ的mRNA及蛋白表达.[结果]成功培养大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并诱导其分化为神经元和神经胶质细胞.PPARγ蛋白存在于NSCs细胞核内,并在NSCs未分化阶段高水平表达,NSCs诱导分化后则表达量随时间延长而逐渐下降.[结论]在NSCs的增殖阶段,PPARγ的表达较高,而在分化过程中,表达量逐渐减少,提示PPARγ可能对NSCs的增殖和分化起重要作用.
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大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞分化调控的Notch-1表达
目的 探讨成年大鼠在发生急性脊髓损伤后,其Notch-1和脊髓内源性神经干细胞(ENSCs)的表达及变化,并探讨其在神经再生过程中的作用.方法 30只雌性SD大鼠(3～6月龄),体重300～350 g,采用随机数字表法分为对照组(n=5)和实验组(n=25).对照组给予椎板减压术;实验组为脊髓损伤组.两组术后1、3d、1、2、4周时进行行为学、组织学检查,采用免疫组化及免疫荧光法检测ENSCs的增殖及Notch-1蛋白的表达.结果 行为学结果示:实验组的大鼠在每个时间点都发生了不同程度的运动功能障碍.组织学结果示:实验组大鼠术后神经纤维结构出现紊乱,水肿及变性.免疫组化结果示:实验组大鼠术后各个时间点的脊髓损伤部位都有Notch-1的表达,第3天时阳性区域面积达高峰.免疫荧光检测示:实验组大鼠损伤节段附近5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)阳性细胞数高于对照组.用立体定量学法检测到脊髓损伤后1周出现的新生有丝分裂细胞约是对照组的75倍左右.用直线回归法分析两组术后不同时间点的BrdU和Notch-1蛋白表达阳性区域的面积呈直线相关.结论 大鼠脊髓损伤后ENSCs和Notch-1的表达有一定相关性.Notch-1的表达增加,可能与大鼠ENSCs的早期增殖有关.
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脑源性神经营养因子对神经干细胞增殖分化的影响
早在1992年,Reynolds等[1]使用一种特殊技术法,分离出能够不断分裂增殖的细胞群落,这些具有多分化潜能的群落当时分离于纹状体,后来发现这些细胞来自室下区,与嗅神经的再生有关,便提出了神经干细胞(NSC)的概念.无疑NSC概念的提出打破了神经元不能再生的传统观念.NSC是一组具有自我更新和多分化潜能的细胞,不仅能诱导分化为神经元,促进脑组织的修复,而且还可以作为载体用于神经系统疾病的基因治疗.如何得到大量的NSC,如何诱导和控制NSC向神经元定向分化极为重要,NSC的分化方向成为现在需要真正解决的问题.Seki[2]的文章中提出微环境有助于NSC的增殖和分化.Rosser等[3]发现植入脑内的NSCs或胚胎神经前体细胞会改变自身原有特性而趋向于适应移植部位的新环境,从而分化为相应的神经细胞.在正常的发育过程中,动物脑部神经干细胞的增殖、分化呈适当的数量比例和部位排列组合,这些过程均与诸多细胞外因子有关,其中有着显著影响作用的生长因子包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子2 (FGF2)和脑源性神经营养因子(BDNF)等.本文就BDNF及其对NSC增殖、分化的影响综述如下.
