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Egr-1特异脱氧核酶调控大鼠血管平滑肌细胞Egr-1及PCNA的表达
目的 采用早期生长反应因子-1(Egr-1)特异脱氧核酶(ED5)转染大鼠主动脉平滑肌细胞,观察其对Egr-1及PCNA表达的影响,从而探讨ED5抑制血管平滑肌细胞增殖的作用机制.方法 组织块贴壁法进行血管平滑肌细胞(VSMCs)原代培养,采用形态学观察和α-平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,然后对VSMCs转染ED5及ED5乱序杂码寡核苷酸(EIYSSCR).实验分三组:对照组、ED5组、ED5SCR组.观察转染后Egr-1及PCNA蛋白表达情况,并分析计算各组积分光密度值大小.结果 成功完成VSMCs原代培养并转染ED5及ED5SCR.经10%胎牛血清刺激后,三组内Egr-1蛋白1 h表达强,随着时间的延长呈下降趋势;PCNA蛋白4 h开始表达,24 h到高峰,之后略呈下降趋势.与对照组及EDSSCR组相比,ED5均在一定程度上抑制了Egr-1及PCNA的表达(P<0.05).结论 ED5可以在一定程度上抑制VSMCs中Egr-1及PCNA的蛋白表达,进而抑制体外培养的VSMCs增殖,这种新的基因治疗方法将为动脉粥样硬化、再狭窄等血管增殖性疾病的治疗提供一种新的途径.
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CⅡTA锤头状核酶抑制Jukart细胞MHCⅡ类抗原的表达
目的针对同种异体细胞移植的免疫反应主要是由主要组织相容性复合物Ⅱ(major histocompatibility complex, MHC-Ⅱ,人类中亦称HLA-Ⅱ)类抗原介导,而MHCⅡ类分子转录激活因子 (MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)对MHCⅡ分子的表达起严格且专一性的调控作用,拟通过抗CⅡTA锤头状核酶(ribozyme,Rz)抑制细胞表面MHCⅡ分子的表达.方法设计并合成针对人类CⅡTA基因第134、218、464位点的一组核酶,分别命名为Rz134、Rz218、Rz464.通过体外制备和活性鉴定,筛选出活性较高的核酶--Rz464.将Rz464克隆到含有核糖体内进入位点及增强型绿色荧光蛋白的表达载体(internal ribosome entry site-enhanced green fluorescent protein,pIRES2-EGFP),简称为pRz464,并稳定转染Jukart细胞株(pRz464-J),流式细胞术检测经典的MHCⅡ(HLA-DR、DP、DQ)抗原表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CⅡTA mRNA水平.结果 pRz464-J与无关核酶组比较,HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了73.27%、88.93%、58.82%;同时CⅡTA的诱导性mRNA含量明显减少(P＜0.01).结论抗CⅡTA锤头状核酶可抑制CⅡ-AT mRNA的表达,从而阻止其调控的相应基因--MHCⅡ分子的表达,为进一步探讨免疫耐受形成及其在防治移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)的前景中奠定了基础.
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脱氧核酶对肝癌细胞AFP mRNA表达影响的研究
目的:本研究针对甲胎蛋白mRNA(AFP mRNA)设计脱氧核酶(DZ),观察其切割AFP mRNA的有效性,探索脱氧核酶在肝癌基因治疗的可能性.方法:体外转录AFP mRNA底物,设计并合成DZ、硫代修饰脱氧核酶(DZs,序列同DZ,但两侧各有两个脱氧核苷酸进行了硫代修饰)、反义寡聚脱氧核苷酸(ASO)、无关DZ对照.体外切割AFP mRNA;经转染试剂将DZ转染入肝癌细胞HepG2,利用RT-PCR法检测AFP mRNA水平的变化;免疫细胞化学及图像分析系统检测AFP蛋白质表达情况;MTT法初步估计肝癌细胞的生长效应.结果:DZ与DZs在体外均可切割AFP mRNA底物,其切割率分别为63.2%与60.9%;经转染DZ、DZs的细胞均下调AFP mRNA的水平,而且DZs的作用更强;经转染DZ与DZs的细胞均下调AFP的表达,ASO也略下调AFP的表达;DZ、DZs有抑制细胞生长的作用.结论:本实验设计的DZ能在细胞外有效切割AFP mRNA;在细胞内也能切割AFP mR-NA、抑制AFP的表达、抑制肝癌细胞的生长,为肝癌的基因治疗提供可能性.
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特异性脱氧核酶对喉癌真核细胞起始因子4E基因mRNA的体外切割作用
目的 研究特异性脱氧核酶(10-23DNAzyme)对喉癌真核细胞起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF4E)基因mRNA的体外切割作用.方法 设计合成针对原癌基因eIF4EmRNA编码区的1102、1289、1226位点的3个10-23DNAzyme-eIF4E,用内切酶Xhol将含有eIF4E基因mRNA的pGEM7zf+eIF4E质粒消化成线性.以此为模板体外转录出用[α-32P]UTP标记的靶eIF4E基因编码区mRNA.在37℃,pH 7.5,Mg2+离子50 mmol/L条件下,分别与3个10-23DNAzyme-eIF4E(1 μmol/L)混合进行切割反应,并比较不同Mg2+离子浓度下酶对靶mRNA的切割活性.反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影,应用凝胶成像分析仪评价酶的切割效率.结果 在设定条件下,3个10-23DNAzyme-eIF4E对eIF4E基因mRNA均有切割活性,且随着Mg2+浓度越高,酶的切割活性增强.结论 3个10-23DNAzyme-eIF4E能有效切割eIF4E基因编码区mRNA,且切割效率与Mg2+浓度有关.
关键词： DNA 催化性 真核细胞起始因子4E 基因疗法 喉肿瘤 -
脱氧核酶及锁核酸核酶对2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg表达的抑制作用
目的:观察针对HBV前C/C区的脱氧核酶(DNAzyme)及锁核酸核酶(LNAzyme)对2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg表达的抑制作用.方法:设计合成针对HBV前C/C区2031位点的10-23DNAzyme、点硫代修饰的10-23DNAzyme及LNAzyme.本实验设对照组和10-23DNAzyme组、点硫代修饰的10-23DNAzyme组、LNAzyme实验组.对照组包括空白对照组、单纯脂质体对照组、单纯10-23DNAzyme对照组、无关10-23DNAzyme对照组.观察在0.16、0.64、1.28、1.60及1.92μmol·L-1浓度下及12、24、36、48、60、72、84及96 h时间段对2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg表达的抑制效应.结果:10-23DNAzyme及LNAzyme作用于2.2.15细胞后,可明显抑制HBsAg、HBeAg的表达,且抑制率LNAzyme明显高于点硫代修饰的10-23DNAzyme,而后者又明显高于未进行任何修饰的10-23DNAzyme组.LNAzyme及点硫代修饰的10-23DNAzyme对HBsAg的高抑制率分别是(91.6±8.4)%和(78.4±2.0)%,对HBeAg的高抑制率分别是(90.1±5.2)%和(76.4±4.8)%;在给药后12 h就表现出抑制效应,48 h达高峰,LNAzymes、点硫代修饰的10-23DNAzyme有效抑制时间分别是为84及72 h.其对2.2.15细胞未见明显的细胞毒性作用.结论:10-23DNAzyme及LNAzyme对2.2.15细胞具有明显的高效阻断HBV的HBsAg、HBeAg表达的作用,且LNAzyme优于DNAzyme,是一类特异的高效的抗HBV治疗剂.
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10-23脱氧核酶体内转染方法研究进展
10-23脱氧核酶(10-23 DNAzyme,10-23DZ)是近年来利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单链DNA分子,能高效、特异催化RNA特定部位的切割反应,实现mRNA水平的基因沉默.目前,10-23DZ已被广泛应用于肿瘤、动脉粥样硬化、感染性疾病等的治疗研究,逐渐成为基因治疗研究的重要手段.如何将其有效地导人机体是10-23DZ进入临床应用的关键问题之一.目前,已有多种递送载体和方法用于10-23DZ的体内转染,如直接注射、电穿孔、脂质体、纳米颗粒、体内表达等.
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小发卡状RNA联合脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞中EB病毒潜伏膜蛋白基因表达研究
目的:探讨小发卡状RNA单独及联合脱氧核酶对鼻咽癌细胞中EB病毒EBV潜伏膜蛋白1(LMP1)基因表达的抑制作用.方法:带绿色荧光报告基团的LMP1mRNA表达载体,小发卡状RNA及脱氧核酶按照阳性对照组、RNA干扰组、联合组和脱氧核酶组4组分别共转染HNE1细胞,观察分析计数细胞中绿色荧光表达情况,检测LMP1mRNA和蛋白表达水平.结果:联合组细胞绿色荧光OD值均数与RNA干扰组差异有统计学意义(P<0.01);联合组绿色荧光抑制率分别为86.31%和88.88%,比RNA干扰组抑制率75.15%高;EBV LMP1mRNA和蛋白水平检测提示联合组抑制效率较RNA干扰组高.结论:小发卡状RNA联合脱氧核酶能够提高抑制EBV-LMP1基因表达的效率.
