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单管多重聚合酶链反应对缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血的基因分析
α-珠蛋白生成障碍性贫血(a地贫)是热带及亚热带常见的单基因遗传病,超过95%的α地贫位于16p13.3[1]上,α珠蛋白基因缺失是导致α地贫的主要原因,即含有1条或2条α-珠蛋白缺失.传统的缺失型α地贫的常用基因分析方法是Southern blot 分析.这种方法存在操作繁琐、实验周期长及使用放射性核素标记等诸多限制,不利于临床推广应用.随后建立起来的聚合酶链反应(PCR)技术也由于各类型的缺失型α地贫在其反应中,因所需试剂及热循环要求不同,对不同缺失型的α地贫需分别进行检测,不能满足临床筛查的需要.为此,我们参照国外的文献[2],设计了单管多重PCR方法,能在单管内一次性完成这3种单基因或多基因缺失的分析.
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葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因诊断方法的建立
目的 建立有效可行的高通量葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)基因诊断新技术.方法 建立单管三重PCR扩增G6PD基因外显子2～13目的片段,构建双管25重SNaPshot反应体系检测25个已报道的中国人群的G6PD基因突变位点.用20份已知基因型的样品进行重复性试验.对60例未知样品同时用多重SNaPshot基因分型技术和DNA测序法进行双盲试验.结果 建立的多重SNaPshot技术可同时检测25个G6PD基因突变位点,且可区分正常、女性杂合子与男性半合子/女性纯合子,有效检出复合突变.批内及批间的重复性均达到100％.60例未知样本检出23例突变,SNaPshot基因分型结果与测序结果完全一致,特异性和准确性均为100％.结论 建立的单管三重PCR结合双管25重SNaPshot技术是一种有效可行的G6PD缺乏症基因诊断的新方法.
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中国人常见G6PD基因突变的快速检测
目的 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症是世界上常见的遗传性红细胞酶缺陷病.本文探讨建立一种简便快速、准确可靠、经济实用的G6PD缺乏症分子诊断技术.方法 采用DNA测序技术通过双盲法对所建立的单管多重PCR结合分子杂交技术进行方法学评价.结果 所建立的新技术可成功地检出上述中国人常见的G6PD基因突变并能清楚区分男性杂合子、女性杂合子或纯合子或双重杂合子.盲法分析结果显示,该技术对经DNA直接测序确诊的G6PD标本的诊断准确度和重复性均达到100%.结论 单管多重PCR结合分子杂交技术可准确、快速地检测中国人常见的G6PD基因突变且具有经济和实用的优点,非常适合于G6PD缺乏症的大人群分子筛查和临床样品的基因诊断.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 基因突变 单管多重聚合酶链反应 反向点杂交 -
重庆地区8024例地中海贫血筛查结果及地贫基因型分析
目的:了解重庆地区人群中α、β地中海贫血基因型的分布情况.方法:送检对象来自重庆各区、县共计8 024例样本,采用单管多重聚合酶链反应法(gap single polymeras chain reaction,GSPCR)结合反向斑点膜条杂交技术(reverse dot blot hybridization,RDB法)同时进行α、β地中海贫血基因检测.各组标本送检之前已在各个医院进行外周血的红细胞数(red blood cell,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,Hb)、红细胞平均体积(mean corpuscular volume,MCV)、红细胞平均血红蛋白(mean corpuscular hemoglobin,MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration,MCHC)细胞、血红蛋白电泳指数测定进行地中海贫血的初筛.8 024例样本男1 267例,女6 757例,0～91岁,按年龄分为儿童组(0～16岁)317例,青壮年组(17～49岁)7 552例,老龄组(50～91岁)155例.结果:8 024例样本共检出α、β地贫111 7例,比例为13.92％.α地贫479例,其中常见缺失型α地贫基因型为--SEA/αα(332例),-α37/αα (84例),-α42/αα(15例),基因型以--SEA/αα为常见,构成比分别为69.31％、17.54％、3.13％,共89.98％;以右缺失为主,--SEA/-α375例,--SEA/-α4.21例.非缺失型42例,占8.76％;确定为β地贫共619例,α复合β地贫19例.β地贫基因型本次研究中共计发现12种基因型,其中常见的突变构成类型分别为CD17(A→T)、CD41-42(-TCTT)、IVS-2-654(C→T)、CD43、TATAboxnt-28(A→T)、βE共占96.12％,其中以CD17(A→T)位点突变所占比例高,CAP点突变和IVS1-1点突变各1例;8 024例样本中男性1 267例,其中地贫167例(13.18％),女性6 757例其中地贫950例(14.06％),男性和女性地贫检测阳性率差异无统计学意义(x2=0.691,P=0.433);男性α地贫77例,女性402例;男性β地贫74例,女性545例,男性检测为α地贫或β地贫与女性的2种地贫检测率之间的差异,无统计学意义(x=0.381,P=0.604);儿童组317例确定为地贫107例(33.75％),青壮年组7 552例确定为地贫982例(13.00％),老年组155例确定地贫28例(18.06％),地贫患者各个年龄组检测阳性无统计学差异(x2=1.711,P=0.318).结论:重庆地区地中海贫血患者中α地中海贫血以--SEA/αα基因型为常见,β地中海贫血则以CDl7(A→T)位点的突变为常见.同时,青壮年组地贫的危害在于青壮年为生育年龄的集中段,所以对青壮年人群进行地贫的筛查和基因诊断,对提高人口素质有重要作用.
关键词： 地中海贫血 α地中海贫血 β地中海贫血 单管多重聚合酶链反应 重庆
