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CagA对AGS细胞Ca2+相关蛋白磷酸化的影响
目的:分析幽门螺杆菌(H pllori)细胞毒素相关蛋白A(CagA)对人胃腺癌黏膜上皮细胞(AGS)Ca2+相关蛋白磷酸化的影响,进一步揭来H pylori的致病机制.方法:采用金属离子亲和吸附富集技术富集H pylori、H pylori CagA缺失株(H pylori △CagA)与AGs细胞相互作用4 h,以及培养相同时间的AGS细胞的磷酸化蛋白.利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白,ImageMaster 2D分析软件识别差异蛋白,MALDI-TOF/OF质谱鉴定确认蛋白.结果:Hpylozi △ CagA作用的AGS细胞.与培养相同时间的AGS细胞比较表达量不变,而Hpylori △CagA作用的AGS细胞表达量发生了明显变化,表明此蛋白的变化是单纯由CagA引起的;此类蛋白点共鉴定出19个,其中3个蛋白点与Ca2+相关.钙离子结合蛋白(nucleobindin-2 precursor,CALNUC)在AGS细胞以及H pylori △CagA与AGS相互作用的2-D胶中表达量接近,而H pylori与AGS相互作用后该蛋白表达量明显降低.结论:H pylori △CagA进AAGS细胞可能会影响内质网、线粒体及高尔基体的钙稳态,诱发内质网、线粒体、高尔基体凋亡或增殖途径.而成为胃炎、胃溃疡、胃癌发生的诱因之一.
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小鼠肝细胞胰岛素与表皮生长因子信号转导磷蛋白质组的对比分析
背景:表皮生长因子和胰岛素都主要通过P13K通路和MAPK通路进行信号转导,但各自的生理功能不同.目的:从细胞整体水平对比分析小鼠肝细胞内胰岛素与表皮生长因子信号转导磷蛋白质组的动力学行为差别,以此找出二者关键性的信号蛋白.设计、时间及地点:随机分组设计的对比观察实验,于2005-07/2006-04在泸州医学院分子生物学实验室完成.材料:实验用肝细胞来源于昆明种封闭群乳小鼠.方法:选取细胞长势相当的肝细胞,采用放射性同位素(32P)对其进行标记,标记后按随机数字表法分为3组,空白对照组、表皮生长因子刺激组(给予10 μg/L表皮生长因子)及胰岛素刺激组(给予100 nmol/L胰岛素).主要观察指标:表皮生长因子、胰岛素分别作用0,5,20,60,120min,采用双向电泳技术分析比较表皮生长因子与胰岛素分别介导的磷酸化蛋白质组的动力学行为,即磷酸化水平.结果:参与两者信号转导的磷蛋白质种类没有多大差异,大多数信号磷蛋白磷酸化水平的动力学行为也表现为一致性,但有4个蛋白点其磷酸化水平随时间变化趋势明显不同.结论:胰岛素与表皮生长因子在同一细胞内参与信号转导的个别信号蛋白其磷酸化水平的动力学行为差别较大,估计这些蛋白就是导致表皮牛长因子与胰岛素终生物学活性的关键蛋白.
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幽门螺杆菌CagA对AGS细胞RNA转录相关磷酸化蛋白的影响
目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)细胞毒素相关蛋白A(CagA)作用后人胃腺癌上皮细胞(AGS)RNA转录相关蛋白磷酸化的变化情况,进一步揭示CagA的致病机制,为寻找生物标记蛋白奠定基础.方法 采用金属离子亲和吸附富集技术富集H.pylori、H.pylori CagA缺失株(H.pylori△CagA)与AGS细胞相互作用4 h、以及培养相同时间的AGS细胞的磷酸化蛋白,利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白,ImageMaster 2D 分析软件比较分析识别差异蛋白,4700型MALDI源蛋白分析器确认蛋白.结果 CagA致使AGS细胞的7个RNA相关的磷酸化蛋白出现差异表达,其中1个磷酸化蛋白表达量上调、4个磷酸化蛋白表达量下调、2个新出现磷酸化的蛋白.hnRNP D0 127位的苏氨酸及137位的丝氨酸发生了磷酸化.结论 CagA作用后,致使hnRNP D0蛋白磷酸化.AGS细胞与RNA转录相关蛋白磷酸化的变化,呈现出诱导细胞凋亡、增殖及有利于细胞免疫逃逸的趋势.
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小鼠肝细胞胰岛素与EGF信号转导磷蛋白质组的动力学行为对比分析
目的 分析小鼠肝细胞内胰岛素与表皮生长因子(EGF)信号转导磷蛋白质组的动力学行为差别,以此找出两者关键性的信号蛋白.方法 采用双向电泳及放射性同位素标记技术,进行分析比较EGF与胰岛素分别介导的磷酸化蛋白质组的动力学行为.结果 参与两者信号转导的磷蛋白质种类没有多大差异,大多数信号磷蛋白磷酸化水平的动力学行为也表现为一致性,但有4个蛋白点其磷酸化水平随时间变化趋势明显不同.结论 胰岛素与EGF虽然在多方面有许多相似之处,但在同一细胞内参与信号转导的个别信号蛋白其磷酸化水平的动力学行为差别较大,估计这些蛋白就是导致EGF与胰岛素终生物学活性有所不同的关键蛋白.
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一种磷酸化蛋白质组定性定量分析方法的考察
目的 对用于磷酸化蛋白质的相对定量分析的一种基于双向差示凝胶电泳(2-D DIGE)技术和Pro-Q Diamond 荧光染色的方法进行考察.方法 采用DIGE技术,从Pro-Q Diamond染色后对Cy2、Cy5荧光强度的影响、Pro-QDiamond染色过程中采用的试剂对CyDye标记的蛋白质的影响、去离子水对DIGE扫描结果的影响、CyDye染料扫描的稳定性影响等方面,考察了该方法的有效性和特异性.结果 在Pro-Q Diamond染色前对DIGE凝胶进行处理的过程中,有多种因素影响荧光强度变化,以致在进行pro-Q Diamond染色后,凝胶点的荧光强度变化无法区分是染色造成的灰度值变化还是CyDye染料自身的变化,从而使通过荧光强度变化来定量检测磷酸化蛋白质变得困难.结论 不宜采用对同一DIGE凝胶进行Pro-Q Diamond再染色检测磷酸化蛋白质的方法进行比较蛋白质组学的定量分析,为能同时展示出胶上的磷酸化蛋白质和总蛋白质,可通过DIGE实验与Pro-Q Diamond分开运行,再通过DIGE扫描图谱与Pro-Q Diamond染色图谱进行匹配的方法进行改进.
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磷酸化蛋白质的检测技术进展
蛋白质的可逆磷酸化修饰是生物体内普遍存在的信息转导调节方式,几乎参与生命活动的所有过程.现分析磷酸化蛋白质的各种方法及其进展,尤其是近年来蛋白质组学技术的发展与应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质的研究成为可能.
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急性淋巴细胞白血病白细胞磷酸化蛋白质分析方法的建立
目的:建立一种对急性淋巴细胞白血病白细胞磷酸化蛋白质分析方法.方法:分离人新鲜外周血白细胞,并随机分为刺激组和对照组.裂解细胞,用Bradford法测定细胞蛋白质含量,利用亲和层析富集白细胞磷酸化蛋白质,SDS-PAGE分离磷酸化蛋白质,采用Scion Image软件分析电泳结果.结果:①电泳图谱显示每条泳道中蛋白质条带清晰,其相对分子量主要介于26～36kDa以及47～65kDa之间.②EGF刺激后出现有磷酸化蛋白质条带的增减或某些磷酸化蛋白质条带灰度的增强或减弱.结论:采用本研究建立的分析磷酸化蛋白质的方法对急性淋巴细胞白血病白细胞GRK相关磷酸化蛋白质进行动态的分析,其方法较简便、结果可信,可为细胞信息传递磷酸化蛋白质组的研究奠定了基础.
关键词： 急性淋巴细胞白血病 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸化蛋白质
