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用MTT和resazurin对一线抗结核药物进行药物敏感性检测的多中心研究
目的:多中心评价两种快速价廉方法,MTT(3-[4.5-二甲基噻唑-2-一价烃基]-2.5-溴化二苯基四唑)和resazurin(刃天青)试验用于一线抗结核药物利福平(RMP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)和链霉素(SM)的药敏检测.方法:30株编过号的结核分枝杆菌被送往拉丁美洲6个国家的7个试验室.每个试验室使用盲法,应用MTT和刃天青显色法进行一线药物利福平、异烟肼,乙胺丁醇和链霉素的药敏检测.获得的低抑菌浓度的结果与传统的罗氏培养基比例法的结果进行对比.结果:确定临界浓度后,RMP,INH和EMB的结果非常好,特异性和敏感性介于96%-99%之间.结论:MTT和刃天青试验是非常有希望的一种方法,为中等资源以及资源贫乏国家进行一线结核药物的快速、价廉药敏试验方法提供了选择.
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标本的采集方法
1 血液标本的采集
正常人的血液是无菌的。当细菌侵入时可引起严重的菌血症或败血症。一般情况下在患者发热初期或发热高峰时采集；对持续性菌血症可随时采集；间歇性菌血症由于菌血症时间短，应预测其体温上升期进行采血。一般在抗菌药物使用前采集2～3次，对已使用抗菌药物又无法停止使用的患者，应在下次用药前采取。
采血的部位应彻底消毒。一般采集肘静脉，宜多部位采集，如两侧肘静脉或动、静脉同时采取，可以排除污染并提高阳性率。或在感染局部的附近血管中采血，可提高阳性率。成人采血量一般5～10ml，婴幼儿1～3ml。采集的血液标本用无菌操作注入装有血液增菌培养基的培养瓶中先进行增菌培养。怀疑有厌氧菌感染时，应抽取血液同时注入需氧培养瓶和厌氧培养瓶中。厌氧培养基通常采用硫乙醇酸盐培养基、牛心脑浸液肉汤等作为增菌培养基，培养瓶密封，将瓶中空气用90％N2、10％CO2替换，形成无氧环境，在培养液中加入刃天青作为指示剂，无氧时无色，有氧时呈红色应弃去不用。无论有否接种标本，血液培养瓶都不得冷藏。 -
硫乙醇酸盐培养基中的刃天青的作用分析
目的分析刃天青在硫乙醇酸盐培养基中的作用.方法按2000版<中国生物制品规程>中培养基灵敏度的测定方法,将0.1%刃天青以不同量加入硫乙醇酸盐培养基中,用厌氧菌株生孢子梭状芽胞杆菌、需氧菌株短芽胞杆菌及乙型溶血性链球菌分别进行不同含量刃天青、煮沸驱氧与未驱氧的灵敏度比较.结果不同刃天青含量与未加刃天青、煮沸驱氧与未驱氧的硫乙醇酸盐培养基的灵敏度无明显差异.结论用以上3个标准菌株检测不同刃天青含量的硫乙醇酸盐培养基的灵敏度,其指示剂的作用不明显.
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微量刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌MIC及菌型鉴定
目的 用刃天青显色法快速测定结核分枝杆菌(MTB)MIC及菌型初步鉴定,并确定抗结核药物折点浓度.方法 用30株国家结核参比实验室熟练度测试质控菌株和64株临床分离菌株为试验菌株,在96孔培养板中,用Middlebrook 7H9液体培养基将抗结核药物进行连续双倍稀释后,加入一定浓度菌液,用刃天青显色法测定MIC.根据罗氏培养基药敏比例法结果,用ROC曲线分析建立显色法药物折点浓度.同时选择24株非结核分枝杆菌(NTM),用对硝基苯甲酸(PNB)进行初步的菌型鉴定.结果 刃天青显色药敏试验5种抗结核药物链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇和氧氟沙星的折点浓度分别为1、0.5、0.5、2、2μg/mL,其敏感性分别为100%、97%、97%、88%和100%,特异性分别为100%、100%、100%、91%和100%.在菌型鉴定中,94株MTB在PNB中均未生长,24株NTM均生长.结果 刃天青显色法测定MIC具有操作简便、快速、成本低廉和准确的优势,且能进行初步的菌型鉴定,适于结核病专业实验室应用.
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刃天青还原法检测细粒棘球绦虫原头蚴总数
目的 建立刃天青还原法体外检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法.方法 根据刃天青在活细胞线粒体酶作用下被还原成强荧光物质的原理,将体外培养的原头蚴,用2 mg/mL刃天青染色10h后,用荧光分光光度计(激发光波长在560 nm,发射长590 nm)测定荧光值,并利用激光扫描共聚焦显微镜形态观察,通过统计学方法建立活原头蚴总数与对应的荧光值之间的数学模型,用于存活原头蚴总数的检测.结果 激光扫描共聚焦显微镜观察发现,死亡的原头蚴经刃天青染色没有荧光,活的原头蚴经刃天青染色发出红色荧光.活原头蚴总数与对应的荧光值呈线性关系,建立直线方程y=0.019x+6.453,在检验中将测得的荧光值(y)带入该公式即可获得活原头蚴总数,此数学模型相关系数r=0.994,P＜0.01,说明每个浓度下活原头蚴总数与每个浓度对应的荧光值之间的相关系数r极显著.结论 本研究建立了刃天青还原法体外快速检测细粒棘球绦虫存活原头蚴总数的实验方法,该方法可应用于抗包虫病药物体外筛选,具有避免人为误差、降低人力消耗等优点.
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裸花紫珠叶抑菌性物质的ASE联合牛津杯和微孔刃天青法筛选
目的 筛选6种不同极性溶剂提取物对6种常见菌抑菌性好的溶剂和菌株.方法 利用快速提取仪(ASE)和6种不同极性溶剂对裸花紫珠叶进行提取,对6种常见菌进行定性的牛津杯法抑菌实验;对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种菌进行定量的微孔板刃天青法筛选实验,测定5种提取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作用测得的(低抑菌浓度)MIC值.结果 除了水提药液,其他5种对不同的菌有不同的抑菌圈,但乙醇和正丁醇段对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都有较好的抑菌圈;在相同作用条件下,相比其他3种提取药液,乙醇和正丁醇有较低的的抑菌浓度,分别为0.022g· m1-1和0.033g·ml-,但正丁醇比乙醇有较高的抑菌性和毒性.结论 终可筛选乙醇作为裸花紫珠叶的提取剂,且可以得出提取液药液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有较好的抑菌性.
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高分子量唾液粘蛋白含量与乳牙患龋相关性的研究
目的:检测儿童唾液中高相对分子质量唾液粘蛋白(MG1)含量,探讨其与乳牙患龋状况之间的关系,为唾液粘蛋白的研究及龋病病因的探讨提供基础资料.方法:随机抽取长沙市两所幼儿园3～5岁305名幼儿进行口腔检查,根据检查结果分为3组,①无龋组:dmft=0;②低龋组:dmft-1～4;③高龋组:dmft≥ 35.随机抽取每组各20名儿童,用刃天青纸片法检测各组的龋活性,然后取所有儿童的非刺激性唾液,用ELISA试剂盒检测MGI的含量,对结果进行统计学分析.结果:①刃天青纸片法显示无龋组、低龋组、高龋组儿童的龋活性差异有统计学意义(P<0.05);②无龋组MGI平均含量为13.63 mg/L,低龋组MGI平均含量为12.96 mg/L,高龋组MGl平均含量为12.61 mg/L.经统计分析,无龋组与高龋组唾液MGI的含量差别有统计学意义(P<0.05),无龋组与低龋组、低龋组与高龋组唾液MGI的含量差异无统计学意义(P >0.05).3～5岁儿童男女比较唾液中MGl含量差异无统计学意义(P>0.05),不同年龄组比较唾液中MGI含量差异无统计学意义(P>0.05).结论:①dmft≥5的儿童龋活性高于dmft < 5的儿童.②无龋组儿童唾液中MGI的含量高于高龋组,儿童唾液中MGI含量与性别和年龄无明显关系.
