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瘦素对人肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1表达的影响
目的 观察瘦素(LP)对人近端肾小管上皮细胞(HK-2)转分化及与转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响,探讨其诱导转分化的机制.方法 不同浓度LP(10、50、100 ng/ml)刺激体外培养的HK-2细胞,以及LP作用不同时间(24、48、72 h)进行分组,倒置显微镜下观察细胞形态学变化;RT-PCR法和Western blot法检测细胞α-SMA、E-cadherin、TGF-β1、FN的表达水平;ELISA法检测上清中TGF-β1蛋白表达量.抗TGF-β1抗体中和实验分析LP对HK-2细胞转分化及与TGE-β1的关系.结果 (1)LP可使HK-2细胞逐渐由椭圆形变成长梭形,类似肌成纤维细胞的形态;(2)LP可下调E-cadherin的表达,同时上调α-SMA、TGF-β1的表达,其作用呈一定的剂量及时间依赖性;(3)抗TGF-β1抗体能够逆转LP诱导的转分化作用.结论 LP通过诱导HK-2细胞发生转分化,参与肾间质纤维化的发生发展,其作用机制与上调TGF-β1的表达有关.
关键词： 瘦素 肾小管 上皮细胞 上皮细胞-间充质转分化 转化生长因子-β1 -
Wnt阻滞剂Dickkopf-1对肾小管上皮细胞转分化的抑制作用
目的 研究Wnt阻滞剂Dickkopf-1 (Dkk-1)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响.方法 体外培养人近端肾小管上皮细胞(HKC),收集后分3组:对照组细胞以含10％胎牛血清的培养基常规培养,TGF-β1组在常规培养基中加入TGF-β1(终浓度20ng/ml),TGF-β1+Dkk-1组同时加入TGF-β1(终浓度20ng/ml)和Dkk-1(终浓度100ng/ml).培养48h后在倒置相差显微镜下进行形态观察,分别采用RT-PCR和Western blotting检测Wnt4、β-catenin、E-cadherin、α-SMA mRNA及蛋白表达情况,细胞免疫荧光染色观察E-cadherin和α-SMA的表达.结果与对照组比较,TGF-β1组和TGF-β1+Dkk-1组Wnt4 mRNA和蛋白表达水平均显著增高(P＜0.05),后两组间差异无统计学意义(P＞0.05).β-catenin mRNA表达在各组之间差异无统计学意义(P＞0.05).β-catenin蛋白在对照组呈低表达,TGF-β1组表达明显上调,TGF-β1+Dkk-1组较TGF-β1组表达下调(P＜0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).E-cadherin mRNA和蛋白在对照组呈高表达,TGF-β1组表达明显降低,TGF-β1+Dkk-1组较TGF-β1组表达显著增高(P＜0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).α -SMA mRNA和蛋白表达在对照组和TGF-β1+Dkk-1组的表达均较TGF-β1组明显降低(P＜0.05).细胞免疫荧光染色显示E-cadherin和α-SMA表达与RT-PCR和Western blotting检测结果一致.结论Wnt阻滞剂DickkopGl能抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化.
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瘦素对人肾小管上皮细胞表型转化及纤维连接蛋白表达的影响
目的:通过观察瘦素(leptin)刺激对人肾小管上皮细胞(HK-2)表型转化和纤维连接蛋白(FN)表达的影响,探讨瘦素对HK-2细胞转分化的作用.方法:将体外培养的HK-2细胞分为对照组和不同浓度瘦素作用组.倒置显微镜下观察HK-2细胞形态学变化;实时荧光定量RT-PCR法检测HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和FN mRNA的表达水平;免疫细胞化学法检测HK-2细胞表达α-SMA的阳性细胞百分数;酶联免疫吸附法(ELISA)检测HK-2细胞培养液上清中FN的表达.结果:分别用50、100、200 ng/ml瘦素作用HK-2细胞48 h后,(1)HK-2细胞逐渐由椭圆形变成长梭形,类似肌成纤维细胞的形态;(2)RT-PCR结果表明,瘦素作用可以下调E-cadherin mRNA的表达,同时上调α-SMA、FN mRNA的表达.(3)免疫细胞化学结果表明,对照组HK-2细胞几乎不表达α-SMA,随着瘦素作用浓度的增加,α-SMA阳性的HK-2细胞百分数逐渐增多;(4)ELISA结果表明,对照组HK-2细胞有基础水平的FN分泌,各瘦素作用组上清液中FN的表达水平较对照组显著增加,且呈一定的剂量依赖关系.结论:瘦素可诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞,分泌细胞外基质,从而可能参与肾间质纤维化的发生发展.
关键词： 瘦素 肾小管 上皮细胞 上皮细胞-间充质转分化 纤维连接蛋白 -
氯沙坦含药血清对肾小管上皮-间充质转分化的抑制作用
目的:肾小管上皮细胞-间充质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)的关键发病机制,而肾小管间质纤维化是慢性肾脏病进展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的重要共同通路.血管紧张素ⅡAT1受体阻断剂氯沙坦对于延缓慢性肾脏病进展有一定的作用,但其能否抑制肾小管上皮细胞-间充质转分化继而抑制肾间质纤维化尚不清楚.本实验通过体外TGF-β1诱导HK-2细胞向间充质细胞转分化,观察氯沙坦对肾小管上皮细胞-间充质转分化的抑制作用及其可能机制.方法:在体外使用TGF-β1诱导HK-2细胞表型改变并给予氯沙坦大鼠含药血清干预.氯沙坦大鼠含药血清按照既定的操作程序获取.HK-2细胞行E-cadherin,Vimentin,β-catenin和ZEB1免疫荧光染色及Western blot分析.结果:TGF-β1诱导肾小管上皮细胞HK-2转化为间充质细胞,细胞形态由卵圆形变为长梭形,上皮标志物E-cadherin表达下调,间充质标志物Vimentin表达上调,上皮细胞-间充质转分化相关分子β-catenin在胞浆、胞核的积聚增多以及ZEB1表达增强;氯沙坦大鼠含药血清能够部分抑制TGF-β1诱导的HK-2转化为间充质表型,并维持HK-2细胞的上皮表型,抑制E-cadherin的表达下调和Vimentin的表达上调;同时抑制β-catenin在胞浆、胞核的积聚以及ZEB1的表达.结论:研究结果提示氯沙坦可抑制体外的肾小管上皮细胞-间充质转分化,其机制可能与氯沙坦抑制β-catenin/ZEB1通路有关.
关键词： 氯沙坦 上皮细胞-间充质转分化 TGF-β1 β-catenin ZEB1 -
氯沙坦对肾间质纤维化的抑制作用
目的 肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是慢性肾脏病进展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的重要共同通路.血管紧张素Ⅱ AT1受体阻断剂--氯沙坦对慢性肾脏病具有保护作用,但其能否抑制肾小管间质纤维化及其可能的机制尚不清楚.本实验通过在体内构建单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠模型,观察氯沙坦对肾小管间质纤维化的抑制作用及其可能机制.方法 50只SD大鼠分为3组:假手术组(n=10),UUO组(n=20),UUO氯沙坦治疗组(n=20).术后氯沙坦治疗组予以氯沙坦灌胃,剂量20 mg·kg-1·d-1.分别在术后第7天、第14天处死大鼠.冰冻组织行E-cadherin,Vimentin,α-SMA,β-catenin和ZEB1免疫荧光染色及Western blot分析.结果 UUO组大鼠第7天组织病理学改变为肾小管管腔扩大,小管萎缩,间质增宽及炎细胞浸润,部分小管间质纤维化;第14天间质纤维化表现更为严重.与对照组相比,UUO模型组大鼠第7天、第14天肾间质上皮标志物E-cadherin表达显著下降,而Vimentin,α-SMA,β-catenin 和ZEB1表达增加.与UUO模型组比较,UUO氯沙坦治疗组大鼠肾小管间质纤维化改变明显减轻,肾组织E-cadherin表达增加,Vimentin,α-SMA,β-catenin 和ZEB1的表达减少.结论 氯沙坦可抑制大鼠体内的肾小管间质纤维化,其机制可能与氯沙坦抑制小管上皮间充质转化相关因子β-catenin/ZEB1的表达有关.
关键词： 氯沙坦 单侧输尿管梗阻 上皮细胞-间充质转分化 β-catenin ZEB1 -
肾脏纤维化的发生机制及治疗新观点
肾脏纤维化,以肾小球硬化和肾小管间质纤维化为特征,是多种慢性肾脏疾病终结局.本质上,肾纤维化是以细胞外基质的过度积聚和沉积为特征的过程.产生基质的细胞活化是肾纤维化形成的关键.
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microRNA-29b在血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用
目的:研究microRNA-29b(miR-29b)在血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的角色.方法:实时定量PCR检测自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)和Wistar-Kyoto (WKY)大鼠肾脏皮质组织miR-29b表达的差异.体外培养NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞,给予血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)10-7 mol/L(为AngⅡ组),以正常培养的细胞作空白对照,实时定量PCR检测AngⅡ组和正常对照组细胞miR-29b表达差异,运用WesternBolt技术和实时定量PCR技术分别检测AngⅡ组和空白对照组TGF-β、α肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(Col Ⅰ)的表达量.进一步分别再转染miR-29b inhibitor和miR-29b mimics,建立miR-29b低表达和高表达细胞模型.低表达模型实验分三组:①空白对照组:正常培养的肾小管上皮细胞未经任何处理；②低表达组:转染miR-29b inhibitor；③阴性对照组:转染随机合成NC microRNA片段.高表达模型实验分三组:①空白对照组:肾小管上皮细胞给予AngⅡ(10-7 mol/L)诱导；②高表达组:肾小管上皮细胞给予AngⅡ(10-7 mol/L)诱导,同时转染miR-29b mimcs；③阴性对照组:肾小管上皮细胞给予AngⅡ(10-7 mol/L)诱导,同时转染随机合成NC microRNA片段.用流式细胞仪技术检测转染率,用实时定量PCR检测转染效果,运用Western Bolt技术和实时定量PCR技术分别检测各组中TGF-β、α-SMA和Col Ⅰ的表达量.结果:实时定量PCR检测SHR大鼠肾脏皮质组织miR-29b的表达(0.76±0.01)相比WKY大鼠(1.00±0.00)下降(P＜0.05),相比空白对照组(1.00±0.00),AngⅡ组miR-29b的表达(0.56±0.06)明显下降(P＜0.05),TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ的mRNA表达和蛋白表达明显升高(P＜0.05).流式细胞仪技术检测NRK-52E细胞转染率为95.14％,相比空白对照组(1.00±0.00),低表达组miR-29b表达(0.07±0.02)明显下降,高表达组miR-29b表达(38.3±8.1)明显升高(P＜0.05).在低表达模型实验中,低表达组α-SMA、TGF-β、Col Ⅰ mRNA表达和蛋白表达比空白对照组和阴性对照组均上调(P＜0.05),而空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).在高表达模型实验中,高表达组的NRK-52E细胞α-SMA、TGF-β、Col I的mRNA表达和蛋白表达比空白对照组和阴性对照组均下调(P＜0.05),而空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论:SHR大鼠肾脏皮质组织miR-29b的表达水平比WKY大鼠下降,这可能和SHR大鼠体内的高AngⅡ水平有关,miR-29b表达降低能促进肾小管上皮细胞发生EMT,AngⅡ调节肾小管上皮细胞发生EMT的一个潜在的机制可能是通过miR-29b来实现的.
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microRNA-101a在尿酸诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用
目的研究尿酸对肾小管上皮细胞间充质转分化的影响及microRNA-101a在其中的作用。方法体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E），分别以0、10、100、500μmol/L的尿酸诱导细胞，采用实时定量PCR检测各组α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）、I型胶原（ColⅠ）及E钙蛋白mRNA的表达水平；Wersten blot检测各组中α- SMA的表达，免疫荧光检测各组中胶原蛋白I（COL）表达水平，观察细胞是否发生转分化。再用实时定量PCR检测各组中miR-101a及COX-2mRNA的表达水平，Wersten blot检测各组中COX-2的表达。进一步实验选择100μmol/L尿酸诱导细胞，并转染miR-101a mimics，分为3组，miR-101a组：先转染miR-101a mimics，再以100μmol/L尿酸培养基培养；空白对照组：以100μmol/L尿酸培养基培养；阴性对照组：细胞转染随机合成的miRNA NC片段，再以100μmol/L尿酸培养基培养。检测各组中α- SMA、ColⅠ、E钙蛋白及COX-2mRNA的表达量。结果培养基中尿酸浓度越高，α- SMA、ColⅠ表达水平也越高，E钙蛋白越低，提示细胞发生转分化，同时miR-101a表达减少，COX-2mRNA表达增多。miR-101a组与空白对照组和阴性对照组比较，α- SMA、ColⅠ及COX-2的表达明显降低（P＜0.05），E钙蛋白明显升高（P＜0.05），空白对照组与阴性对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论尿酸诱导肾小管上皮细胞转分化可能呈浓度依赖性， miR-101a及COX-2可能参与尿酸诱导肾小管上皮细胞转分化的调节过程。
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厄贝沙坦对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的抑制作用
目的 探讨厄贝沙坦对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠肾间质纤维化的抑制作用及其可能机制.方法 25只SD大鼠随机分为假手术组5只、UUO组和UUO厄贝沙坦治疗组(厄贝沙坦组)各10只,UUO组和厄贝沙坦组建立UUO大鼠模型,术后厄贝沙坦组给予厄贝沙坦50 mg/(kg·d)灌胃,假手术组及UUO组大鼠以等量蒸馏水灌胃.术后第14天,取大鼠肾组织行Masson染色,观察肾脏组织病理改变并进行肾间质纤维化评分,采用Western blot法检测肾组织钙黏蛋白(E-cadherin)、a-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、β-链蛋白(β-catenin)、Snail1蛋白表达情况.结果 术后第14天,假手术组大鼠肾组织形态结构基本正常;UUO组大鼠出现明显肾小管萎缩,间质炎细胞浸润,间质增宽及小管间质纤维化表现;厄贝沙坦组大鼠肾组织病理学改变较UUO组明显减轻;UUO组大鼠肾间质纤维化评分(2.35±0.21)高于厄贝沙坦组(1.58±0.34)和假手术组(0.23±0.16)(P＜0.05),厄贝沙坦组高于假手术组(P＜0.05);术后第14天,UUO组大鼠肾组织E-cadherin表达水平(0.41±0.21)低于假手术组(1.31±0.13)和厄贝沙坦组(0.72±0.16),α-SMA、β-catenin和Snail1表达水平(1.50±0.23、1.47±0.14、1.25±0.06)高于假手术组(0.46±0.19、0.51±0.11、0.29±0.17)和厄贝沙坦组(0.86±0.26、0.77±0.21、0.68±0.24)(P＜0.05);厄贝沙坦组大鼠肾组织E-cadherin表达水平低于假手术组,α-SMA、β-catenin和Snail1蛋白表达水平高于假手术组(P＜0.05).结论 厄贝沙坦可部分抑制UUO大鼠肾间质纤维化,其机制可能与抑制β-catenin/Snail1通路有关.
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靶向沉默转化生长因子β1表达的短发夹 RNA的筛选
目的：筛选可靶向沉默转化生长因子β1（TGF－β1）表达的短发夹RNA（shRNA）。方法：设计和制备靶向沉默TGF－β1的5条shRNA，并构建靶向沉默TGF－β1的p－Genesil－shRNA真核表达重组质粒及含无关shRNA的 p－Genesil－1－shRNA－vect对照质粒，酶切和测序方法进行鉴定。通过脂质体介导分别将p－Genesil－1－shRNA－vect质粒和各重组表达质粒转染入高糖或AngⅡ环境激活的HKC细胞（分别命名为p－Genesil－1－vect细胞及p－Genesil－shRNA 1～5细胞），Western blot方法检测沉默TGF－β1表达的效果。结果：酶切和测序结果显示，5种重组质粒均可切出与预计相符的目的片段，所有shRNA编码序列与设计一致。与HKC细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的HKC细胞和p－Genesil－1－vect细胞中TGF－β1表达均增高（F＝74．188，P＜0．001），而后二者之间TGF－β1表达差异无统计学意义（P＞0．05）。与高糖或AngⅡ刺激的p－Genesil－1－vect细胞相比，高糖或AngⅡ刺激的各组p－Genesil－shRNA细胞中TGF－β1表达均降低（F＝139．695，P＜0．001）。结论：筛选出1条可靶向沉默TGF－β1表达的shRNA。
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高尿酸通过PI3K/Akt信号通路促进肾小管上皮细胞转分化
目的 探讨高尿酸诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化(EMT)的作用及机制.方法 体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),用不同浓度的尿酸(100、200、400、600、800 μmo]/L UA)刺激48 h诱导其转分化,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,Western印迹法检测各组细胞内E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Akt和磷酸化(p)-Akt蛋白的表达,荧光显微镜观察细胞E-cadhern及α-SMA分布的改变.选用400μmol/L UA作为观察剂量,用不同浓度PI3K/Akt通路抑制剂LY294002(0、2.5、5、10、15 μmol/L)预处理NRK-52E 1 h后以UA刺激48 h,Western印迹法检测对照组和干预组细胞内p-Akt和Akt蛋白表达的变化.将NRK-52E分为4组:对照组、UA组、LY294002组、UA+LY294002组,Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,免疫荧光观察细胞E-cadherin、α-SMA、p-Akt分布的改变.结果 正常NRK-52E细胞表达E-cadherin,而α-SMA蛋白表达较少;400、600、800 μmol/L UA组细胞α-SMA蛋白表达增加(均P＜0.05),E-cadherin蛋白表达减少(均P＜ 0.05),p-Akt蛋白表达增多(均P＜0.05),Akt蛋白表达没有明显变化(均P＞ 0.05).细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明UA诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功,同时激活了PI3K/Akt通路.LY294002(10、15 μmol/L)预处理后再以尿酸诱导NRK-52E 48 h,p-Akt表达减少(均P＜0.05),表明PI3K/Akt通路抑制有效.10 μmol/LLY294002预处理后再以尿酸刺激NRK-52E细胞,与UA组比,E-cadherin蛋白表达增多(P＜0.05),α-SMA蛋白表达减少(P＜0.05),逆转了UA诱导的肾小管上皮细胞EMT.结论 高尿酸可诱导肾小管上皮细胞EMT,可能是通过上调PI3K/Akt信号通路.
关键词： 尿酸 肾小管 上皮细胞 上皮细胞-间充质转分化 PI3K/AKT -
CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响
目的 观察骨架调节蛋白CIP4(Cdc42 interacting protein 4)对转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化(EMT)的影响,并探讨其产生的机制.方法 10 μg/TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)向间充质转分化.Western 印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达.倒置显微镜观察细胞形态的变化.根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段(CIP4-siRNA)和含野生型CIP4的重组真核表达质粒(pcDNA3.1-hCIP4),利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞.Western 印迹法检测埘照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)1μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化.结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少(P＜0.05),α-SMA 蛋白表达显著增多(P＜0.05),细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功.CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多(P＜0.05＝,α-SMA蛋白表达显著减少(P＜0.05),部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT.pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少(P＜0.05),α-SMA蛋白表达显著增多(P＜0.05),诱导了肾小管上皮细胞EMT.用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少(P＜0.05).结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程.
