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糖化作用对新城疫病毒HN糖蛋白功能的影响
为了研究糖化作用对新城疫病毒(NDV)HN糖蛋白生物学活性的影响,特别是对HN促细胞融合作用的影响,采用基因定点突变技术分别去掉HN分子上的4个糖化位点,然后检测各突变株的细胞表面表达情况、受体识别特性、神经氨酸酶活性、促细胞融合作用、免疫沉淀特性等.结果表明,将野毒株NDV HN的细胞表面表达效率定为100%时,D198R-HN突变株的表达效率为82.6%;而对二者的G1、G2、G3和G4 4个糖化位点分别进行定点突变时,得到8种突变株.它们的表达效率均有不同程度的降低,D198R-HN-G2和D198R-HN-G4两种突变株与D198R-HN相比更为明显.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变株的受体识别活性分别为突变前的47.95%、68.49%、42.67%和41.10%;而D198R-HN突变株的G1、G3和G4突变株的受体识别活性突变前后变化不明显,只有D198R-HN-G2突变株的受体识别活性得以恢复较多,从原来的10.96%恢复到32.88%.野毒株HN突变后神经氨酸酶活性普遍降低,尤以G4影响明显,仅为野毒株的9.60%;而D198R-HN突变株突变后神经氨酸酶活性普遍升高,尤以G2恢复高,由原来的0.45%恢复到7.59%.野毒株HN的G1、G2、G3和G4突变前后细胞融合情况变化不大;而D198R-HN的G1、G2、G3和G4突变后,D198R-HN-G1、D198R-HN-G3、D198R-HN-G4没有变化,但D198R-HN-G2使D198R-HN的细胞融合活性得以恢复30.90%.野毒株HN电泳时呈现1条较宽的泳带,当突变掉1个糖化位点时,泳动速度加快.D198R-HN突变株及D198R-HN-G1、D198R-HN-G3和D198R-HN-G4 HN突变株电泳时,呈现两条模糊不清的条带.但D198R-HN-G2突变株HN电泳时,其条带变得窄而锐利,且泳动速度快.上述结果说明糖链能影响HN的表达或从细胞浆运输到细胞表面,G2对HN的受体识别活性影响较大,推测G2糖链部分结构的改变影响到了HN G2周围的表型特性,从而导致神经氨酸酶活性、促细胞融合作用的改变.
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多种缺损及突变的PrP蛋白在杆状病毒中的表达和纯化
PrP蛋白多肽序列上存在有不同的功能区域,影响着蛋白质构象、理化特性和生物学功能.为了获得不同缺损及突变的仓鼠PrP蛋白,以PCR方法获得不同大小的PrP基因片段,利用PCR大引物点诱变法获得带有突变糖基化位点PrP序列.所有PCR产物测序鉴定正确后,分别与pFASTBAC Hb质粒连接,与穿梭载体DH10BAC转座,构建各种重组病毒.Western blot证实,8种不同长度的仓鼠PrP蛋白可在昆虫细胞Sf9中表达,包括全序列的PrP1-231,信号肽缺失的PrP23-231;N端缺损的PrP90-231和PrP120-231;C端缺损的PrP1-199、PrP1-174和PrP1-160.糖基化位点突变:PrP23-231(N181Q).其中不带信号肽序列的PrP蛋白均呈HIS融合蛋白,而N端带有信号肽的PrP蛋白则不能与Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱结合,但可以同PrP特异性抗体发生免疫沉淀反应.这提示PrP信号肽序列在昆虫细胞中可能也发挥着与哺乳动物细胞相似的作用.不同缺损及突变的PrP蛋白的表达和纯化为进行蛋白生物学性状研究奠定了基础.
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干扰素-β1b的高效表达、纯化及抗病毒活性研究
IFN-β1b是大肠杆菌产生的17位Cys被Ser替换的人IFN-β的类似物,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了IFN-β-1b基因,插入质粒pBV220中,转化大肠杆菌DH5α.IFN-β1b的制备过程,包括发酵和一系列的纯化步骤.经修饰,IFN-β1b基因在启动子PRPL控制下发酵表达,合成的蛋白质以包涵体的形式存在.培养的细菌经收集、裂解后,将包涵体释放出来,包涵体经含SDS的溶液溶解,DTT还原.纯化过程包括有机溶剂抽提、分子筛层析、脱盐、氧化复性和反相层析,并用旋转蒸发除去有机溶剂.IFN-β-1b在不同种系来源的细胞上显示不同的抗病毒活性.
关键词： 干扰素 表达 纯化 反相高效层析(HPLC) -
流行性乙型脑炎病毒GSS株prM、E和NS1蛋白基因的克隆及在非复制型痘苗病毒中的表达
克隆流行性乙型脑炎(乙脑)病毒野毒(JEV)GSS株前膜蛋白信号序列、前膜蛋白(prM)、包膜蛋白(E)、非结构蛋白-1(NS1)和非结构蛋白NS2a的编码基因,并与非复制型痘苗病毒载体NTV进行同源重组,构建了乙脑病毒非复制型重组痘苗病毒疫苗株NTVA(E/L)JEV.通过PCR和Southern blot检测证明,在非复制型痘苗病毒中有乙脑病毒prM信号序列、prM、E、NS1和NS2a基因的插入:Western blot检测证明,重组病毒可以在细胞内成功地表达prM、E和NS1蛋白,并可将prM、E和NS1蛋白分泌到细胞培养上清中;免疫荧光检测证明,E和NS1蛋白主要分布在细胞膜上.电镜下可见分泌到细胞外的病毒样颗粒.
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不同区段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统中的表达及检测
利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,将从一株HIV-1阳性克隆质粒中获得的几个HIV包膜蛋白基因片段,克隆入转移载体中得到重组病毒.用此重组病毒感染昆虫细胞后表达出3种HIV包膜蛋白,即GP120-41P、GP41T、GP41P,分别含有HIV-1包膜糖蛋白GP120及部分GP41,删除了N端12个疏水氨基酸的GP41和仅有主要表位约240个氨基酸的GP41.收获后分别以Western-blotting和EIA检测,有较好的免疫学活性,其中GP41T的活性强.该实验为HIV包膜蛋白的结构研究提供了依据,加以改进后可能有免疫检测的价值.
关键词： Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统 人免疫缺陷病毒 包膜蛋白 抗原 表达 -
传统DNA疫苗载体与Semliki森林病毒复制子对HIV-1 Pr55gag表达与体液免疫原性的比较性研究
为探索Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA载体可否用于HIV疫苗的候选载体,对该载体与传统DNA疫苗载体对HIV-1Pr55gag的表达与体液免疫原性进行了系统比较研究.将野生型(wtgag)及密码子改造(syngag)的HIV-1 ⅢB gag基因分别克隆于SFV DNA载体及传统DNA疫苗载体[pCDNA3.1(+)],对其Pr55gag细胞内表达水平、Pr55gag病毒样颗粒释放、以及在BALB/c鼠的体液免疫原性进行了比较.在293T、H1299、C2C12和BHK细胞系中,SFV-wtgag可以Rev非依赖方式有效表达Pr55gag,而pC-wtgag转染的细胞不能有效表达Pr55gag,从而不能诱导小鼠产生免疫反应.虽然SFV质粒的细胞转化效率明显低于pCDNA载体,SFV-wtgag和SFV-syngag在细胞内Pr55gag的表达量与pC-syngag相似,而Pr55gag病毒样颗粒的释放明显低于pC-syngag.在肌内注射免疫的小鼠中,低剂量(0.1和1.0μg)的SFV及pCDNA gag表达质粒均未诱导出GAG特异性免疫反应.在高剂量(10,30,100μg)免疫组中,与SFV gag表达质粒相比,pC-syngag可诱导出较高水平的TH1型GAG特异性抗体.SFV-syngag较SFV-wtgag可诱导出高水平的体液免疫反应.结果提示,SFV衍生的复制子单独使用不能在小鼠诱导出优于传统DNA疫苗载体的HIV-1 GAG特异性体液免疫反应,其原因可能与病毒样颗粒的释放有关.密码子改造的gag基因的优势在SFV载体系统中得到了进一步证实.
关键词： HIV-1 Semliki 森林病毒 DNA 疫苗 表达 免疫原性 -
猪瘟病毒p80基因NTPase/RNA解旋酶功能区在E.coli中的表达
采用PCR技术扩增出猪瘟病毒GXYL株和C株p80基因的NTPase/RNA解旋酶功能区(sGXNS3和sCNS3),将其克隆到表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-sGXNS3和pET-sCNS3.PCR、酶切和序列分析鉴定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确.1.0mmol/L IPTG诱导得到分子量为26kD的目的蛋白,Western blot检测表明,表达的目的蛋白能被CSFV阳性血清识别.
关键词： 猪瘟病毒(CSFV) p80基因 克隆 表达 -
鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达
鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA.参照IBV Beaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT-PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因.扩增产物经Bst YⅠ、HaeⅢ和PstⅠ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型.将IBV H株S1基因克隆于pGEM-T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1 611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97.39%和97.27%.将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ-A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS-PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测,证实了表达产物的抗原特异性.
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 纤突蛋白S1基因 克隆 毕赤酵母 表达 -
按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达
人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难.而尖锐湿疣与HPV6感染之间是单一的因果关系,这为用疫苗预防提供了可能.实际上HPV(如16、18、6、11等型别)L1的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗正在进行Ⅱ期临床试验,前景看好[1].但是现在普遍采用昆虫细胞培养系统,价格昂贵.为降低成本,同时尝试了真核表达系统甲醇营养型酵母(Pichiapastoris)和原核表达系统大肠杆菌(E.coli)两种表达系统.按照Pichia酵母的密码偏爱性重新合成HPV6-L1基因,结果在该系统仅有少量表达[2].但是发现该合成基因在E.coli中能够高效表达,而目前文献报道的HPV L1蛋白多以融合方式(与GST)在E.coli中少量表达[3].现将工作结果报道如下,并对影响蛋白表达的可能因素作简要探讨.
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减蛋综合征病毒六邻体重组蛋白的表达和初步应用
减蛋综合征(egg drop syndrome 1976,EDS-76)是由腺病毒科禽腺病毒属Ⅲ群腺病毒即减蛋综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV) 引起的以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋，产蛋率严重下降为主要特征的传染病。
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家蚕浓核病毒(镇江)株主要结构蛋白基因的克隆及表达
家蚕浓核病毒(Bombyx mori densovirus,BmDNV)是一种昆虫细小病毒.与其它昆虫细小病毒感染昆虫体内多种组织不同,家蚕浓核病毒只感染家蚕中肠上皮组织的圆筒型细胞,感染该病毒细胞的细胞核可以被孚尔根和甲基绿浓染,在病毒感染的早期中肠上皮组织细胞数量增加,形成褶皱,后感染细胞脱落到肠腔中[1-3].自从20世纪70年代末日本学者证实家蚕浓核病是由于家蚕浓核病毒感染引起的以来[4],已经分离得到了多个病毒株系[5-8].根据它们在血清学、理化特性、品种感受性和病理特征等方面的差异,分为BmDNV-1(伊那株)和BmDNV-2(以山梨株为代表)[8-11].
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庚型肝炎病毒NS3蛋白在昆虫细胞中的表达
庚型肝炎病毒(HGV)/GB病毒C(GBV-C)疑似引起人类庚型肝炎[1～3].HGV和GBV-C为同一病毒的两个不同分离株,本文将其称为GBV-C/HGV.GBV-C/HGV属黄病毒科,为单股正链RNA病毒,全长约9.4kb.基因组中仅含有一个单一开放阅读框,编码E1、E2结构蛋白和NS2、NS3、NS4及NS5非结构蛋白.GBV-C/HGV的NS3蛋白具备丝氨酸蛋白酶活性和解旋酶活性[3],在NS3蛋白中还存在线性抗原表位[4],因此,NS3蛋白是GBV-C/HGV的重要功能蛋白.
关键词： GBV-C/HGV NS3蛋白 Sf9昆虫细胞 表达 -
禽呼肠孤病毒分离株P10、P17、δ3蛋白基因的表达及抗血清的制备
禽呼肠孤病毒的感染在我国鸡群中非常普遍,它除了可引起鸡传染性关节炎外,还可能引起矮小综合症和免疫抑制等.从鸡群中分离到的不同毒株ARV的毒力差别较大,抗原性也不尽相同[1].ARV是一种双股RNA病毒,病毒颗粒中的基因组有10个不同的独立节段组成[2].其中对S1节段研究的比较详细,而对其它节段的研究尚不深入.现已知,ARV的S1节段有3个ORF,分别编码P10、P17和δ3三种蛋白质[3,4 ].其中δ3是一种结构蛋白,并可能与病毒吸附宿主细胞及病毒中和反应相关[5].而P10和P17为非结构蛋白,但其中P10与感染细胞后细胞膜融合相关[6].为此,Bodelon等[4]在大肠杆菌中分别表达S1节段的P10、P17和δ3三个基因,同时比较了这三个基因产物对细菌膜通透性的影响.
关键词： 禽呼肠孤病毒 P10、P17、δ3蛋白 表达 免疫荧光试验 抗血清 -
大黄鱼虹彩病毒腺苷三磷酸酶(ATPase)基因的克隆与表达
虹彩病毒(iridovirus)是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的致病病原,由虹彩病毒所致疾病给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失.近年来,许多国家相继报道了在患病鱼、蛙和龟等水生经济动物中分离到虹彩病毒[1-4].
关键词： 大黄鱼 虹彩病毒 腺苷三磷酸酶(ATPase) 昆虫细胞 表达 -
表达鸡传染性支气管炎病毒JS/95/03株S1蛋白的重组杆状病毒构建
鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是鸡的一种急性、高度接触性传染性疾病,以呼吸道症状、肾炎和蛋产量和蛋品质下降为主要特征.由于病毒的高度变异性,产生了众多的血清型,不同血清型间缺乏有效的交叉保护作用,给免疫预防带来了很大的困难.近年来,该病的流行呈上升趋势,已成为继新城疫、传染性法氏囊病和马立克氏病后的又一大传染病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失.
关键词： 传染性支气管炎病毒(IBV) S1基因 S1蛋白 杆状病毒表达载体 表达 -
风疹病毒JR23株E1包膜糖蛋白基因的表达分析
风疹病毒(rubella virus,RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员.通常RV感染症状较轻,表现为急性、轻型、病程短、自限性出疹性疾病.RV对公众健康的大威胁是它的致畸特性.妇女妊娠期,尤其是前3个月感染RV可导致新生儿产生一系列的器官畸形,称为先天性风疹综合征(CRS)[1].
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癌性抑制因子2A、转化生长因子β1在脑神经胶质瘤中的表达研究
目的 研究癌性抑制因子2A(CIP2A)、转化生长因子β1(TFF-β1)在脑神经胶质瘤的表达及意义.方法 选取2012年3月至2013年10月我院收治的30例脑神经胶质瘤患者,采用免疫组化法测定患者CIP2A及TFF-β1的表达,另选取正常脑组织30例作为对照组,观察两组患者各项指标的差异,并分析其临床意义.结果 观察组患者TGF-β1、CIP2A阳性率均显著高于对照组,且随着肿瘤分级的提高,患者阳性表达率也随之提高,差异有明显的统计学差异(P＜0.05).结论 在脑神经胶质瘤患者肿瘤组织中,TGF-β1、CIP2A表现为大幅升高,而这两个指标不在正常人脑组织中表达,对这两种指标的检测,对脑神经胶质瘤病情的评估有重要的意义.
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LIM结构域结合蛋白1在脑胶质瘤患者中的表达研究
目的 观察LIM结构域结合蛋白1(LIM-domain-binding 1,Ldb1)在脑胶质瘤患者中的表达.方法 采用Real-timePCR方法检测46例脑胶质瘤手术患者脑组织、18例正常对照和16例良性脑肿瘤对照脑组织标本中Ldb1 mRNA的表达水平;采用免疫组化EnVision二步法观察Ldb1在高级别胶质瘤中的蛋白表达定位.结果 脑胶质瘤患者脑组织Ldb1的mRNA表达高于正常对照组和良性脑肿瘤对照组.Ldb1在不同分级的胶质瘤中表达并不相同,在Ⅲ、ⅣV级中的相对表达量明显高于Ⅰ、Ⅱ级(P ＜0.001).在高级别胶质瘤中,Ldb1蛋白主要表达在肿瘤细胞核和胞浆内.结论 脑胶质瘤患者肿瘤组织中Ldb1表达增高,可能参与了胶质瘤的发生、发展过程.
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NPM1在结直肠癌的表达及临床价值
目的 观察核仁磷酸蛋白(NPM1)在结直肠中的表达及其意义.方法 用免疫组化法对50例结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的NPM1表达进行分析.结果 NPM1在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P ＜0.001);NPM1表达上调与肿瘤直径、TNM分期、Dukes分期、淋巴结转移及远处转移显著相关,而与患者性别、年龄及结直肠癌分化水平无关(P＞0.05).结论 NPM1的表达与结直肠癌的发生发展有关.
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鼻咽癌组织中CD133的表达情况与放疗预后的关系研究
目的 分析鼻咽癌癌组织中CD133的表达情况与放疗预后的关系.方法 选取我院2013年7月至2015年6月期间收治的经病理活检确诊的初治鼻咽癌患者50例,采用免疫组织化学染色方法分析活检的鼻咽病变组织CD133蛋白表达情况,然后行常规放射治疗,原发灶剂量68 ～72Gy,评估放疗近期疗效,并进行预后随访.结果 ①CD133蛋白在鼻咽癌组织中呈高表达,表现为胞膜及胞质呈棕色阳性染色,且阳性表达率68.00％.②CD133蛋白在鼻咽癌组织中的表达与TNM分期、淋巴结转移及放化疗疗效有关(P＜0.05),与年龄、性别等无关(P＞0.05),其中CD133蛋白阳性表达者放疗后RR为61.76％明显低于阴性表达者的93.75％(P＜0.05).③CD133蛋白阳性表达者放化疗后3年总生存率、无进展生存率分别为67.65％、35.29％明显低于阴性表达者的93.75％、68.75％ (P ＜0.05).结论 CD133作为鼻咽癌干细胞较特异的表面标志物,在鼻咽癌组织呈高表达,与肿瘤病理特征密切相关,且可作为放疗预后的预测指标.
