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表达鸡传染性支气管炎病毒JS/95/03株S1蛋白的重组杆状病毒构建
鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是鸡的一种急性、高度接触性传染性疾病,以呼吸道症状、肾炎和蛋产量和蛋品质下降为主要特征.由于病毒的高度变异性,产生了众多的血清型,不同血清型间缺乏有效的交叉保护作用,给免疫预防带来了很大的困难.近年来,该病的流行呈上升趋势,已成为继新城疫、传染性法氏囊病和马立克氏病后的又一大传染病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失.
关键词： 传染性支气管炎病毒(IBV) S1基因 S1蛋白 杆状病毒表达载体 表达 -
MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定
目的 真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV) S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定.方法 以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBacl质粒,构建重组质粒pFB1-S1.将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代.将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96 h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48 h的sf9细胞进行IFA鉴定. 结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212 bp,与预期相符.重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确.重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确.IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达.SDS—PAGE显示纯化的重组S1为单一100×103 (Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别. 结论 成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础.
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结核分枝杆菌S1蛋白的原核表达条件优化
目的 对结核分枝杆菌S1蛋白的表达质粒进行表达条件优化.方法 将构建的表达质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白,对细菌浓度、IPTG终浓度、诱导温度和诱导时间进行筛选,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测不同表达条件的细菌培养上清中目的蛋白的表达量.结果 SDS-PAGE检测中,在细菌浓度OD600为0.8,IPTG的终浓度为0.5 mM,诱导表达的温度为25℃,诱导16 h的条件下,S1蛋白的条带灰度值和相对占比为本体系下佳.结论 建立了S1蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达的佳条件.
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冠状病毒HcoV-229E S1蛋白的原核表达及鉴定
目的 克隆表达冠状病毒HcoV-229E S1基因片段,表达S1蛋白.方法 合成冠状病毒HcoV-229E S1蛋白特异性基因片段并克隆入pET21a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG高效诱导表达得到重组蛋白,用金属螯合亲和层析纯化,并通过Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定.结果 获得了主要以包涵体形式存在的目的蛋白,Western blot鉴定其为S1基因片段蛋白.结论 成功构建了HcoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21(DE3)中得到了高效表达,为下一步表达蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保护性测定打下了基础.
关键词： 冠状病毒HcoV-229E S1蛋白 原核表达 -
鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定.方法 用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞.强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水.用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性.结果 经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBVSczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C 10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600.2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应.结论 成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料.
关键词： 鸡传染性支气管炎病毒 S1蛋白 单克隆抗体 -
SARS冠状病毒S1蛋白的原核表达与鉴定
目的克隆SARS冠状病毒(SARS-CoV)S1基因片段,构建原核表达载体,并在宿主菌中诱导表达带组氨酸标记的融合蛋白.方法人工合成SARS-CoV S1基因片段,克隆至pUCm-T载体,经DNA序列分析和酶切后,将酶切片段亚克隆至原核表达载体pET-28b(+),重组子pET-28b/SARS-S1转化大肠杆菌ril,IPTG诱导表达,Western blot鉴定表达产物;纯化表达产物并用ELISA检测其抗原特异性.结果获得了主要以包涵体形式存在的32kD的目的蛋白,Western blot 鉴定其为带组氨酸标记的融合蛋白,ELISA证明其能与合成肽的抗体及病人血清中的SARS-CoV的抗体特异结合.结论成功构建了SARS-CoV S1基因的组氨酸标记表达载体pET-28b/ SARS-S1,并在ril中得到了高效表达 ;表达的S1蛋白具有较好的抗原特异性,便于免疫动物以获得特异抗体,为SARS-CoV的实验室快速诊断打下了基础.
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SARS冠状病毒S蛋白部分序列的克隆与表达
[目的]表达SARS冠状病毒S蛋白部分序列S1.[方法]采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码S1蛋白的基因片段,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组表达质粒pQE30-S1,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生S1重组蛋白.[结果](1)RT-PCR扩增获得长约1150bp的S1基因片段.(2)SDS-PAGE证明,S1重组蛋白的分子量约为40kDa.(3)表达的蛋白能与SARS病人血清反应.[结论]成功构建了SARS冠状病毒S1蛋白的重组表达质粒,该质粒在大肠杆菌中表达了S1蛋白.
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重组SARS-CoV S1蛋白抗原表位分析及抗原性检测
目的 对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spike, S)S1段进行原核重组表达,并检测表达产物的抗原性.方法 对S1中的HLA抗原表位进行预测分析,根据分析结果选定用于重组表达的区段,利用pET21b载体进行原核表达,将产物纯化后利用SARS抗血清进行抗原性检测.结果 抗原表位分析表明,S1中包含有多个能够被HLA分子有效提呈的抗原表位,综合考虑表位肽的分布、重组表达的效率、重组蛋白的空间构象以及引物设计的优化等因素,选取S1中的关键区域259～565 aa进行原核重组表达,得到了包涵体形式的重组蛋白,经过纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性S1蛋白;用SARS抗血清对此重组蛋白进行免疫学鉴定,表明该蛋白具有SARS特异的抗原性.结论 重组表达的S1蛋白具有较强的抗原性,为进一步的疫苗研究和抗体筛选奠定了基础.
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SARS-CoV S1蛋白在甲醇营养型酵母中表达及鉴定
目的获得保持生物学活性、易于纯化、高产量的严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrom coronavirus,SARS-CoV)S1蛋白,以便进一步研究S1蛋白及其抗体的功能.方法将SARS-CoV S1基因重组入酵母表达载体pMETαA,经过酶切和测序鉴定后,通过电穿孔法将重组质粒S1-pMETαA转化入宿主酵母菌株PMAD11,使其在甲醇的诱导下表达目的蛋白.后用覆盖分析法对重组转化子初步分析,SDS-PAGE和Wesntern blotting法鉴定目的蛋白的表达和特异性.结果酶切鉴定和测序结果证实了S1基因成功地克隆到pMETαA载体中;覆盖分析、SDS-PAGE和免疫印迹法证实S1基因得到正确的表达.结论利用酵母表达系统,成功地克隆和表达了SARS-CoV S1蛋白,为进一步纯化该蛋白和研究其功能奠定了基础.
