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抑制TNFR/RIPK信号通路对大鼠急性脊髓损伤后神经功能的影响
目的:探讨应用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)抑制TNFR/RIPK介导的坏死性凋亡信号通路对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的作用.方法:72只雄性SPF级SD大鼠,体重0.25～0.30kg,随机分为4组:假手术组(Sham组,A组)、假手术+Necrostatin-1组(Sham+Nec-1组,B组)、SCI+二甲基亚砜(DMSO)(DMSO组,C组)、SCI+Nec-1组(Nec-1组,D组).C、D组采用钳夹法制作大鼠急性SCI模型.所有大鼠硬膜下置管,A组不给药,B组和D组造模后30min经导管注射1μl Nec-1(25μg/μl),C组注射等量DMSO,1次/d,至取材时间点.各组分别于造模后12h、24h和3d三个时间点每组取6只大鼠,先行Basso/Beattie/Bresnahan (BBB)评分,再处死动物取脊髓组织.12h时间点动物处死前1h腹腔注射碘化丙啶(propidine iodide,PI)1 mg/kg,取材检测脊髓组织PI红染细胞数;24h时取材采用苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓损伤情况、尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目、Western Blot (WB)检测Bcl-2、坏死性凋亡蛋白RIPK1及RIPK3的表达水平;3d时取材行Tunel染色观察细胞凋亡情况.结果:造模后A组和B组各时间点的BBB评分均正常,C、D组各时间点均显著性低于A、B组,D组各时间点的BBB评分均显著高于同时间点C组(P＜0.05).造模后12h,D组PI红染细胞较C组明显减少,神经元崩解减轻(P＜0.05).造模后24h,A组和B组脊髓组织HE和Nissl染色正常,D组脊髓组织损伤程度和存活神经元数量均优于C组,差异有统计学意义(P＜0.05);A组和B组Bcl-2、RIPK1及RIPK3均低水平表达,C组RIPK1及RIPK3表达显著性升高,D组Bcl-2表达较C组上调,RIPK1及RIPK3表达显著性下降,C、D两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).造模后3d,A组和B组可见少量凋亡小体,C组和D组明显增多,但D组凋亡小体数量较C组明显减少(P＜0.05).结论:抑制TNFR/RIPK信号通路可以减轻大鼠急性SCI后的病理变化,改善行为学评分,促进脊髓神经功能恢复.
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RIPK1抑制糖皮质激素体外诱导的间充质干细胞凋亡
目的 研究受体相互作用蛋白激酶1 (receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)抑制糖皮质激素(glucocorticoid,GC)体外诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的凋亡效果及其调控机制.方法 将SD大鼠来源的MSC,分为3组:GC+ MSC组,GC+ RIPK1-MSC组和生理盐水+MSC组(对照组).通过形态学观察、MTT分析、AO/EB染色、Hoechest 333342染色、Live/Dead染色、TUNEL凋亡检测及Western blot分析等方法确定抑制效果,并分析其中涉及的关键蛋白和信号通路.结果 GC诱导24 h后,MSC发生凋亡,并证实RIPK1可对抗这种凋亡.RIPK1上调伴随TRAF2/cIAP1/cFLIPL水平升高,其为对抗凋亡的关键蛋白通路.结论 RIPK1可抑制GC诱导的MSC凋亡,为早期阻遏股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)提供了新思路.
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miR-497调控SALL4-RIPK1轴促进肝癌MHCC97L细胞坏死
目的:探讨miR-497促进肝癌MHCC97L细胞坏死作用机制.方法:(1)质粒转染miR-497,经H2O2诱导后,Annexin V-FITC/PI双染流式分析肝癌细胞凋亡和坏死;(2)过表达miR-497和SALL4后,western blot分析RIPKI蛋白表达情况;(3)293T细胞共转染miR-497和pMIR-SALL4-Luc质粒后,荧光素酶实验检测其荧光素强度.结果:(1)过表达miR-497,经H2O2诱导后,活细胞明显下降,而细胞坏死增加;(2) western blot分析得出过表达miR-497和SALL4的MHCC97L细胞内的RIPK1蛋白表达均上调;(3)荧光素酶实验证实了miR-497直接靶向SALL4.结论:miR-497通过调控SALL4-RIPK1轴促使肝癌MHCC97L细胞坏死.
